Smad4基因靜默促進PanIN細胞惡性轉化相關基因的篩選及驗證.pdf

1、背景與目的：
　　 胰腺癌惡性程度高，預后極差。我們己建立的小鼠基因打靶模型證實，KrasG12D突變啟動了胰腺癌前病變胰腺導管上皮內瘤變（pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN）。Smad4基因失活可使KrasG12D突變啟動的PanIN發(fā)生惡性轉化。但PanIN細胞中Smad4基因靜默后其下游基因表達將如何改變，進而促進PanIN細胞惡性轉化，目前尚不清楚?；诖?，本課題運用含

2、有41174條小鼠基因轉錄本的全基因表達譜芯片，研究Smad4基因靜默后PanIN細胞基因表達譜的變化。
　　 方法：
　　 1. 應用小鼠全基因芯片檢測Smad4基因靜默前后PanIN細胞基因表達譜的變化（即PanIN細胞與PanIN-S細胞），對差異表達基因進行分析與功能注釋。并運用實時熒光定量多聚酶鏈反應(Real-time PCR)對部分芯片結果進行驗證。
　　 2.在體外實驗中，運用Matrigel腫瘤

3、細胞侵襲試驗，檢測和比較Smad4基因靜默前后，PanIN細胞的侵襲與遷移能力。挑選腫瘤細胞侵襲與遷移相關差異表達基因，運用Real-time PCR及免疫印跡（West Blot）進行驗證。
　　 3. 動物實驗中，構建PanIN及PanIN-S細胞組裸鼠移植瘤模型，繪制生長曲線，并運用Real-time PCR及免疫組化方法分析移植瘤新生血管形成相關差異表達基因的表達水平。
　　 結果：
　　 1.根據(jù)基因芯

4、片篩選出差異倍數(shù)2倍以上的差異表達基因共237條，上調148條，下調89條。通過Real-time PCR對部分結果的驗證表明，基因芯片的結果與Real-time PCR驗證結果基本一致。
　　 2.腫瘤細胞侵襲實驗結果顯示，Smad4基因靜默后的PanIN-S細胞侵襲與轉移能力明顯增強。Real-time PCR驗證結果顯示，PanIN-S細胞MMP2的mRNA水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）；PanIN-S細胞TI

5、MP4、PITX2的mRNA水平顯著低于PanIN細胞（p<0.05）。Western Blot結果顯示，PanIN-S細胞MMP2蛋白表達水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）；PanIN-S細胞TIMP4、PITX2蛋白表達水平顯著低于PanIN細胞（p<0.05）。
　　 3.動物模型結果顯示，PanIN-S組的移植瘤體積顯著高于PanIN組（p<0.05）；Real-time PCR驗證結果顯示，PanIN-S細胞P

6、IK3CB和CXCR4 mRNA水平顯著高于PanIN細胞（p<0.05）。免疫組化結果顯示，PanIN-S組PI3Kinase p110 beta與CXCR4表達水平顯著高于PanIN組（p<0.05）。
　　 結論：
　　 1.通過基因芯片技術篩選出Smad4基因靜默前后，即PanIN細胞與PanIN-S細胞差異表達基因，為后續(xù)體內、外實驗奠定了良好的基礎。
　　 2.通過體外實驗表明，Smad4基因靜默可以