健脾補腎方防治家兔激素性股骨頭壞死的實驗研究.pdf

1、1研究目的
　　 研究探討健脾補腎方防治SINFH的有效途徑和作用靶點,以便更好的指導臨床應用,提高臨床療效,發(fā)揮中醫(yī)藥防治SINFH的優(yōu)勢。
　　 2研究方法
　　 健康成年家兔50只隨機分為5組(n=10):模型組、空白對照組、健脾補腎高劑量組(簡稱高劑量組)、健脾補腎中劑量組(簡稱中劑量組)和健脾補腎低劑量組(簡稱低劑量組)。模型組及觀察組按Matsui方法結合前期預實驗結果復制家兔SINFH模型,即以甲潑

2、尼龍琥珀酸鈉20mg/kg/d的劑量臀肌注射,連續(xù)3天,同時予青霉素2萬u/kg肌注,每周2次,預防感染。各治療組動物分別以高(5.52g/kg/d)、中(2.76 g/kg/d,相當于60kg體重成人每千克所需劑量的2.3倍)、低(1.38g/kg/d)劑量灌胃健脾補腎方湯藥,連續(xù)12周。模型組與空白對照組灌胃蒸餾水5g/kg/d,連續(xù)12周。
　　 在首次給藥后的1、4、8和12周,灌胃后12小時,采血檢測血脂TG、CHO、

3、HDL、LDL和PT、APTT、AT-III等凝血指標。末次采血后處死全部動物,取雙側股骨頭連同干骺端組織行HE染色,光鏡下觀察骨小梁、骨細胞、髓腔脂肪細胞的變化。在Image-pro plus4.5圖形分析系統下定量觀察,求出空骨陷窩率以及脂肪組織面積。石蠟切片行masson染色,Image-pro plus4.5圖形分析系統下定量觀察軟骨及骨小梁內膠原分布并計算綠染的膠原面積。
　　 末次給藥后以健脾補腎高劑量組和空白對照組

4、為動物來源制備含藥血清,冷存?zhèn)溆谩５?2周處死動物前,于空白組任取2只家兔分離得到MSCs。取經鑒定和純化的第3代細胞,隨機分為健脾補腎加成骨組、成骨組、健脾補腎組和空白對照組4組,各組以相應培養(yǎng)液培養(yǎng)。分別于誘導后的第2、4、8、12、16天,各誘導組進行ALP活性的檢測；更換培養(yǎng)液22d后,各組標本用四環(huán)素標記法行礦化結節(jié)染色,光鏡下計數鈣結節(jié)的數量。
　　 采用SPSS12.0軟件進行數據統計分析,組間計量資料數據比較采用

5、單因素方差分析,組間股骨頭壞死率的比較采用卡方檢驗；計量資料數據以均數±標準差((x)±S)表示,P<0.05為有統計學意義。
　　 3研究結果
　　 3.1血液學檢測
　　 模型組與正常對照組比較,4w、8w和12w時上述各項血脂和凝血指標差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01)；各治療組與模型組比較,在治療后的4w和(或)8w和(或)12w,上述各項指標差異顯著或非常顯著(P<0.05或P<0.01)

6、。各治療組的治療作用具有劑量依賴性。
　　 3.2組織形態(tài)學觀察結果及病理分級結果
　　 HE染色結果:各組空骨陷窩率由大到小排列為模型組>低劑量組>中劑量組>高劑量組>空白組。正常空白對照組無一例出現SINFH,模型組12w時有7只出現SINFH,發(fā)生率為77.8％(7/9),與正常對照組比較有顯著統計學意義(P<0.01)。各治療組發(fā)生率分別為:高劑量組22.2％(2/9)且病理分級均為Ⅰ級,與模型組比較有統計學意義

7、(P<0.05)；中劑量組50％(5/10)、低劑量組70％(7/10),與模型組比較無統計學意義(P>0.05)。各治療組間SINFH發(fā)生率比較:高劑量組與低劑量組比較有統計學意義(P<0.05),而高劑量與中劑量組及中劑量與低劑量組之間比較無統計學意義。
　　 Masson染色結果:正常對照組骨小梁綠染極少,主要為紅染；模型組與正常對照組比較,模型組骨小梁中以及邊緣可見大量綠染膠原,膠原面積相比具有顯著差異(P<0.01)；

8、各治療組與模型組比較骨小梁綠染面積明顯減少(P<0.01),組織以紅染為主；治療組間綠染的膠原面積高劑量組與低劑量組比較有統計學意義(P<0.05),而高劑量與中劑量組及中劑量與低劑量組之間比較無統計學意義。
　　 3.3健脾補腎方藥物血清對MSCs定向分化的影響
　　 ALP活性檢測結果:更換相應培養(yǎng)液的第8、12和16天時,空白對照組與健脾補腎加成骨組和成骨組比較有統計學意義(P<0.05)；12天時,空白對照組與健

9、脾補腎組比較有統計學意義(P<0.05)；從第8天之后,健脾補腎加成骨組ALP活性高于成骨組(P<0.05)；各組在12天ALP活性最高,12天時按ALP活性由高到低排列為健脾補腎加成骨組>成骨組>健脾補腎組>空白對照組。
　　 礦化結節(jié)四環(huán)素熒光標記結果:更換培養(yǎng)液22d后,健脾補腎加成骨組、成骨組及健脾補腎組每個標本染色后均可見到大小不一、圓形或不規(guī)則的金黃色結節(jié),形成的金黃色結節(jié)在熒光強度、大小、數量上都明顯優(yōu)于空白對照組

10、,在空白對照組所有標本中僅偶見。計數形成的鈣結節(jié)數量,與空白對照組比較,其余3組形成的鈣結節(jié)數量明顯多于空白組,差異非常明顯(P<0.01)；健脾補腎加成骨組鈣結節(jié)數量多于成骨組(P<0.05)。各組形成的鈣結節(jié)數量由多到少排列為:健脾補腎加成骨組>成骨組>健脾補腎組>空白對照組。
　　 4結論
　　 4.1連續(xù)三次大劑量注射LPS可成功復制家兔的SINFH模型,此方法簡單易于實行且家兔中途死亡率低,值得推薦。