家蠶mago nashi基因的克隆、序列分析及原核表達研究.pdf

1、生殖質是在許多物種卵子發(fā)生中形成的一種特殊細胞質成分，含有這種成分的細胞才能發(fā)育為生殖細胞。對果蠅研究表明，magonashi基因是生殖質組裝和形成的一個關鍵基因，其編碼的蛋白質能識別并結合某些生殖質決定基因的RNA，形成復合體，穿過核膜進入核質區(qū)域，指導生殖質的正確組裝形成。從低等的真核生物酵母到高等的哺乳動物人，都存在magonashi的同源基因并且相似性非常高。 為進一步闡明家蠶生殖發(fā)育的調控機制，在家蠶基因組、EST數據

2、以及芯片數據分析的基礎上，本論文對果蠅中已報道的生殖質決定相關基因在家蠶中的同源基因進行了鑒定，并對其表達模式進行了分析，然后對高度保守的magonashi基因進行了克隆和原核表達，以期為以后深入了解該基因的功能研究奠定基礎，獲得結果如下： 1.果蠅生殖質決定相關基因在家蠶中的同源基因分析從FlyBase下載果蠅生殖質形成相關基因18個(aubergine，spire，nanos，torso，tudor，vasa，pumilio

3、,par-1，cappuccino，staufen，oskar，valois，germ-cellless,polar-granulecomponent，mtlrRNA，magonashi，tsunagi，exuperantia)，通過與家蠶基因組數據進行BLAST比對分析，發(fā)現(xiàn)除oskar，valois，germ-cellless,polargranulecomponent，mtlrRNA5個基因外，其余13個基因在家蠶中均有同源基因，

4、并根據基因芯片數據分析了預測的家蠶生殖質形成相關基因的表達模式。發(fā)現(xiàn)在這些同源的生殖質形成相關基因中，有5個基因(Bmcapu，Bmnos，Bmvas，Bmaub，Bmexu)在雌雄發(fā)育后期有顯著差異表達；有4個基因(Bmtud，Bmmago，Bmtsu，Bmstau)在雌雄發(fā)育過程中無差異表達；有3個基因(Bmnos，Bmvas，Bmaub)在生殖腺中特異表達；有6個基因(Bmcapu，Bmmago，Bmtsu，Bmexu，Bmsta

5、u，Bmtud)除在生殖腺中表達外，還在其它組織有高表達。 2.家蠶magonashi基因的克隆及mRNA表達檢測根據預測序列設計引物，進行RT-PCR擴增和克隆測序驗證，成功地克隆到家蠶magonashi基因完整的編碼區(qū)序列。分析發(fā)現(xiàn)該基因位于nscaf2655上，只有一個完整的拷貝，在基因組上有1611bp，共有兩個外顯子，分別為258bp和183bp，并且外顯子、內含子邊界符合典型的GT-AG結構。克隆的magonashi

6、基因完整的編碼區(qū)序列為441bp，編碼146個氨基酸殘基。RT-PCR檢測了該基因在發(fā)育各時期各組織器官的表達情況，發(fā)現(xiàn)該基因在所檢測的所有發(fā)育時期、組織器官均有表達，是一個非特異表達基因。 3.家蠶magonashi基因的原核表達將家蠶magonashi基因的編碼區(qū)序列克隆到原核表達載體pET28-a中，并將構建成的pET-magonashi重組質粒轉化表達宿主菌EscherichiacoliBL21(DE3)細胞，IPTG誘