促肝細胞生長素對肝衰竭患者血漿體外培養(yǎng)肝細胞的影響.pdf

1、目的：促肝細胞生長素（PHGF）用于臨床治療肝衰竭（HF）已有多年，但PHGF對HF的作用機制尚未十分明確。既往研究表明PHGF對成人肝細胞（HH）的增殖具有一定的作用，本實驗擬通過復(fù)制HF細胞模型，研究PHGF對該模型的影響，并探討藥物作用的可能機制，為HF的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 方法：本實驗采用肝衰竭患者血漿（LFP）添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞，復(fù)制體外HF細胞模型。實驗分為七組：胎牛血清（FBS）添加到

2、DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞組（FBS組）；正常人血漿（NHP）添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞組（NHP組）；HF細胞模型PHGF未干預(yù)組（LFP組）；HF細胞模型10μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細胞模型20μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細胞模型40μg/mlPHGF干預(yù)組、HF細胞模型80μg/ml PHGF干預(yù)組。采用倒置相差顯微鏡觀察FBS組、NHP組、LFP組細胞形態(tài)，以及PHGF作用于HF模型后細胞形態(tài)的變化

3、。采用臺盼藍（trypanblue）染色、細胞增殖計數(shù)法（CCK-8）檢測不同實驗組、不同時間點（24h、48h、72h）細胞生長增殖情況；應(yīng)用流式細胞術(shù)（FCM）檢測HH細胞凋亡和DNA合成的變化；通過活性熒光定量檢測法檢測細胞色素P4503A4（CYP4503A4）酶活性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測CYP4503A4在mRNA水平表達量的改變。 結(jié)果：倒置顯微鏡下FBS組、NHP組中細胞形態(tài)正常；LFP組刪細

4、胞失去原有形態(tài)；40μg/ml PHGF干預(yù)LFP組后細胞形態(tài)接近正常，且數(shù)目較未干預(yù)LFP組明顯增多。臺盼藍、CCK-8檢測結(jié)果顯示FBS組、NHP組中HH細胞生長良好，LFP組HH細胞呈抑制狀態(tài)，PHGF體外干預(yù)后HH細胞的增生呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。 FCM檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示，F(xiàn)BS組為（1．87±0．18）％；NHP組為（2．68±0．39）％；LFP組為（30．13±3．95）％；40μg/mlPHGF組為（20．

5、14±2．88）％。與FBS組、NHP組相比，LFP組凋亡率增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與LFP組相比，40μg/ml PHGF組HH細胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與FBS、NHP組相比，LFP組G0/G1期增加，S期、G2/M期分布減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組G0/G1期相對減少，S期、G2/M期分布增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 活性熒光定量檢測酶活性結(jié)果顯示，F(xiàn)BS組為0．481±0．048

6、 nmol/（mg．min），NHP組為0．396±0．040 nmol/（mg．min），LFP組為0．196±0．020 nmol/（mg．min），40μg/mlPHGF組為0．264±0．025 nmol/（mg．min）；與FBS組、NHP組相比，LFP組CYP4503A4酶活性降低；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA酶活性上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR檢測mRNA灰度比值，F(xiàn)BS組為1

7、．001±0．072，NHP組為0．985±0．061，LFP組為0．503±0．038，40μg/mIPHGF組為0．726±0．048；與FBS組、NHP組相比，LFP組CYP4503A4 mRNA基因表達下降；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA基因表達上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論：LFP體外培養(yǎng)HH細胞適合作HF的細胞模型；PHGF可能通過降低細胞凋亡，促進細胞增殖分裂，增強CYP450