促肝細胞生長素對肝衰竭患者血漿體外培養(yǎng)肝細胞的影響.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:促肝細胞生長素(PHGF)用于臨床治療肝衰竭(HF)已有多年,但PHGF對HF的作用機制尚未十分明確。既往研究表明PHGF對成人肝細胞(HH)的增殖具有一定的作用,本實驗擬通過復(fù)制HF細胞模型,研究PHGF對該模型的影響,并探討藥物作用的可能機制,為HF的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 方法:本實驗采用肝衰竭患者血漿(LFP)添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞,復(fù)制體外HF細胞模型。實驗分為七組:胎牛血清(FBS)添加到

2、DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞組(FBS組);正常人血漿(NHP)添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細胞組(NHP組);HF細胞模型PHGF未干預(yù)組(LFP組);HF細胞模型10μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細胞模型20μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細胞模型40μg/mlPHGF干預(yù)組、HF細胞模型80μg/ml PHGF干預(yù)組。采用倒置相差顯微鏡觀察FBS組、NHP組、LFP組細胞形態(tài),以及PHGF作用于HF模型后細胞形態(tài)的變化

3、。采用臺盼藍(trypanblue)染色、細胞增殖計數(shù)法(CCK-8)檢測不同實驗組、不同時間點(24h、48h、72h)細胞生長增殖情況;應(yīng)用流式細胞術(shù)(FCM)檢測HH細胞凋亡和DNA合成的變化;通過活性熒光定量檢測法檢測細胞色素P4503A4(CYP4503A4)酶活性;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測CYP4503A4在mRNA水平表達量的改變。 結(jié)果:倒置顯微鏡下FBS組、NHP組中細胞形態(tài)正常;LFP組刪細

4、胞失去原有形態(tài);40μg/ml PHGF干預(yù)LFP組后細胞形態(tài)接近正常,且數(shù)目較未干預(yù)LFP組明顯增多。臺盼藍、CCK-8檢測結(jié)果顯示FBS組、NHP組中HH細胞生長良好,LFP組HH細胞呈抑制狀態(tài),PHGF體外干預(yù)后HH細胞的增生呈現(xiàn)時間和劑量依賴性。 FCM檢測細胞凋亡率結(jié)果顯示,F(xiàn)BS組為(1.87±0.18)%;NHP組為(2.68±0.39)%;LFP組為(30.13±3.95)%;40μg/mlPHGF組為(20.

5、14±2.88)%。與FBS組、NHP組相比,LFP組凋亡率增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與LFP組相比,40μg/ml PHGF組HH細胞的凋亡率降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。與FBS、NHP組相比,LFP組G0/G1期增加,S期、G2/M期分布減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與LFP組相比,40μg/mlPHGF組G0/G1期相對減少,S期、G2/M期分布增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 活性熒光定量檢測酶活性結(jié)果顯示,F(xiàn)BS組為0.481±0.048

6、 nmol/(mg.min),NHP組為0.396±0.040 nmol/(mg.min),LFP組為0.196±0.020 nmol/(mg.min),40μg/mlPHGF組為0.264±0.025 nmol/(mg.min);與FBS組、NHP組相比,LFP組CYP4503A4酶活性降低;與LFP組相比,40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA酶活性上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。RT-PCR檢測mRNA灰度比值,F(xiàn)BS組為1

7、.001±0.072,NHP組為0.985±0.061,LFP組為0.503±0.038,40μg/mIPHGF組為0.726±0.048;與FBS組、NHP組相比,LFP組CYP4503A4 mRNA基因表達下降;與LFP組相比,40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA基因表達上調(diào),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論:LFP體外培養(yǎng)HH細胞適合作HF的細胞模型;PHGF可能通過降低細胞凋亡,促進細胞增殖分裂,增強CYP450

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