促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素對(duì)肝衰竭患者血漿體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：促肝細(xì)胞生長(zhǎng)素（PHGF）用于臨床治療肝衰竭（HF）已有多年，但PHGF對(duì)HF的作用機(jī)制尚未十分明確。既往研究表明PHGF對(duì)成人肝細(xì)胞（HH）的增殖具有一定的作用，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)復(fù)制HF細(xì)胞模型，研究PHGF對(duì)該模型的影響，并探討藥物作用的可能機(jī)制，為HF的臨床治療提供一定的理論依據(jù)。 方法：本實(shí)驗(yàn)采用肝衰竭患者血漿（LFP）添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細(xì)胞，復(fù)制體外HF細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為七組：胎牛血清（FBS）添加到

2、DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細(xì)胞組（FBS組）；正常人血漿（NHP）添加到DMEM培養(yǎng)液中體外培養(yǎng)HH細(xì)胞組（NHP組）；HF細(xì)胞模型PHGF未干預(yù)組（LFP組）；HF細(xì)胞模型10μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細(xì)胞模型20μg/ml PHGF干預(yù)組、HF細(xì)胞模型40μg/mlPHGF干預(yù)組、HF細(xì)胞模型80μg/ml PHGF干預(yù)組。采用倒置相差顯微鏡觀察FBS組、NHP組、LFP組細(xì)胞形態(tài)，以及PHGF作用于HF模型后細(xì)胞形態(tài)的變化

3、。采用臺(tái)盼藍(lán)（trypanblue）染色、細(xì)胞增殖計(jì)數(shù)法（CCK-8）檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)組、不同時(shí)間點(diǎn)（24h、48h、72h）細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)HH細(xì)胞凋亡和DNA合成的變化；通過(guò)活性熒光定量檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞色素P4503A4（CYP4503A4）酶活性；逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)CYP4503A4在mRNA水平表達(dá)量的改變。 結(jié)果：倒置顯微鏡下FBS組、NHP組中細(xì)胞形態(tài)正常；LFP組刪細(xì)

4、胞失去原有形態(tài)；40μg/ml PHGF干預(yù)LFP組后細(xì)胞形態(tài)接近正常，且數(shù)目較未干預(yù)LFP組明顯增多。臺(tái)盼藍(lán)、CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示FBS組、NHP組中HH細(xì)胞生長(zhǎng)良好，LFP組HH細(xì)胞呈抑制狀態(tài)，PHGF體外干預(yù)后HH細(xì)胞的增生呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴(lài)性。 FCM檢測(cè)細(xì)胞凋亡率結(jié)果顯示，F(xiàn)BS組為（1．87±0．18）％；NHP組為（2．68±0．39）％；LFP組為（30．13±3．95）％；40μg/mlPHGF組為（20．

5、14±2．88）％。與FBS組、NHP組相比，LFP組凋亡率增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LFP組相比，40μg/ml PHGF組HH細(xì)胞的凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與FBS、NHP組相比，LFP組G0/G1期增加，S期、G2/M期分布減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組G0/G1期相對(duì)減少，S期、G2/M期分布增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 活性熒光定量檢測(cè)酶活性結(jié)果顯示，F(xiàn)BS組為0．481±0．048

6、 nmol/（mg．min），NHP組為0．396±0．040 nmol/（mg．min），LFP組為0．196±0．020 nmol/（mg．min），40μg/mlPHGF組為0．264±0．025 nmol/（mg．min）；與FBS組、NHP組相比，LFP組CYP4503A4酶活性降低；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA酶活性上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-PCR檢測(cè)mRNA灰度比值，F(xiàn)BS組為1

7、．001±0．072，NHP組為0．985±0．061，LFP組為0．503±0．038，40μg/mIPHGF組為0．726±0．048；與FBS組、NHP組相比，LFP組CYP4503A4 mRNA基因表達(dá)下降；與LFP組相比，40μg/mlPHGF組CYP4503A4 mRNA基因表達(dá)上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論：LFP體外培養(yǎng)HH細(xì)胞適合作HF的細(xì)胞模型；PHGF可能通過(guò)降低細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖分裂，增強(qiáng)CYP450