兔ADSCs與人HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng)誘導(dǎo)成ESCs的研究.pdf

1、研究目的： 應(yīng)用共培養(yǎng)方法體外誘導(dǎo)脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）向表皮干細(xì)胞（ESCs）分化，探討其作為組織工程化皮膚種子細(xì)胞的可行性。 研究方法： 1.選用兔齡3～4月大白兔，用貼壁法及Ⅰ型膠原酶法從脂肪組織中分離出細(xì)胞，進(jìn)行體外長(zhǎng)期傳代及大量增殖培養(yǎng)，并觀察及檢測(cè)其生物學(xué)特性，以鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪來(lái)源干細(xì)胞（ADSCs）。 2.復(fù)蘇人HaCaT細(xì)胞株，并體外擴(kuò)增培養(yǎng)。 3.實(shí)驗(yàn)分組：①共培養(yǎng)3

2、天的ADSCs；②共培養(yǎng)7天的ADSCs；③第三代ADSCs。采用插入式細(xì)胞培養(yǎng)器（Transwell）與六孔板來(lái)構(gòu)建體外共培養(yǎng)模型，將HaCaT細(xì)胞和ADSCs分別種于上室和下室內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。對(duì)共培養(yǎng)后的ADSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察鑒定，對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行角蛋白K19，Pan-CK和β1整合素三個(gè)指標(biāo)的免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè)，并用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究結(jié)果： 1.ADSCs生物學(xué)特性：①原代及傳代的兔ADSCs均呈長(zhǎng)梭

3、形或三角形貼壁生長(zhǎng)，形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）相似。②傳代的兔ADSCs生長(zhǎng)曲線呈“S”形，群體倍增時(shí)間為22h～25h。③免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD29， CD44表達(dá)陽(yáng)性；而CD34， CD45表達(dá)陰性。 2.共培養(yǎng)后的ADSCs：①在形態(tài)上，共培養(yǎng)后的ADSCs細(xì)胞體積變大，橫徑變粗，由原來(lái)的細(xì)長(zhǎng)梭型變成粗長(zhǎng)梭型或短棒狀，形態(tài)向表皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)化，并處于未成熟期；②在免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中，共培養(yǎng)后的ADSCs均表達(dá)角蛋白K1

4、9， Pan-CK和β1整合素陽(yáng)性，共培養(yǎng)7天的較共培養(yǎng)3天的ADSCs表達(dá)抗體陽(yáng)性率增高，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)果表明共培養(yǎng)后的ADSCs為第三代ADSCs、表皮干細(xì)胞（ESCs）和暫時(shí)增殖細(xì)胞（TA細(xì)胞）的混合體。 研究結(jié)論： 1.膠原酶消化法可以獲得純度較高的ADSCs。 2.兔ADSCs與人HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng)，可誘導(dǎo)向ESCs分化。 3.用Transwell體外構(gòu)建HaCaT與