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1、研究目的: 應(yīng)用共培養(yǎng)方法體外誘導(dǎo)脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)向表皮干細(xì)胞(ESCs)分化,探討其作為組織工程化皮膚種子細(xì)胞的可行性。 研究方法: 1.選用兔齡3~4月大白兔,用貼壁法及Ⅰ型膠原酶法從脂肪組織中分離出細(xì)胞,進(jìn)行體外長(zhǎng)期傳代及大量增殖培養(yǎng),并觀(guān)察及檢測(cè)其生物學(xué)特性,以鑒定所培養(yǎng)細(xì)胞為脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSCs)。 2.復(fù)蘇人HaCaT細(xì)胞株,并體外擴(kuò)增培養(yǎng)。 3.實(shí)驗(yàn)分組:①共培養(yǎng)3
2、天的ADSCs;②共培養(yǎng)7天的ADSCs;③第三代ADSCs。采用插入式細(xì)胞培養(yǎng)器(Transwell)與六孔板來(lái)構(gòu)建體外共培養(yǎng)模型,將HaCaT細(xì)胞和ADSCs分別種于上室和下室內(nèi)進(jìn)行共培養(yǎng)。對(duì)共培養(yǎng)后的ADSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀(guān)察鑒定,對(duì)3組細(xì)胞進(jìn)行角蛋白K19,Pan-CK和β1整合素三個(gè)指標(biāo)的免疫細(xì)胞學(xué)檢測(cè),并用SPSS15.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。 研究結(jié)果: 1.ADSCs生物學(xué)特性:①原代及傳代的兔ADSCs均呈長(zhǎng)梭
3、形或三角形貼壁生長(zhǎng),形態(tài)與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)相似。②傳代的兔ADSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈“S”形,群體倍增時(shí)間為22h~25h。③免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CD29, CD44表達(dá)陽(yáng)性;而CD34, CD45表達(dá)陰性。 2.共培養(yǎng)后的ADSCs:①在形態(tài)上,共培養(yǎng)后的ADSCs細(xì)胞體積變大,橫徑變粗,由原來(lái)的細(xì)長(zhǎng)梭型變成粗長(zhǎng)梭型或短棒狀,形態(tài)向表皮細(xì)胞系轉(zhuǎn)化,并處于未成熟期;②在免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)中,共培養(yǎng)后的ADSCs均表達(dá)角蛋白K1
4、9, Pan-CK和β1整合素陽(yáng)性,共培養(yǎng)7天的較共培養(yǎng)3天的ADSCs表達(dá)抗體陽(yáng)性率增高,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明共培養(yǎng)后的ADSCs為第三代ADSCs、表皮干細(xì)胞(ESCs)和暫時(shí)增殖細(xì)胞(TA細(xì)胞)的混合體。 研究結(jié)論: 1.膠原酶消化法可以獲得純度較高的ADSCs。 2.兔ADSCs與人HaCaT細(xì)胞體外共培養(yǎng),可誘導(dǎo)向ESCs分化。 3.用Transwell體外構(gòu)建HaCaT與
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