過表達Ack1通過Crk信號通路促進肝細胞癌侵襲轉(zhuǎn)移.pdf

1、肝細胞癌(HCC)是全球最為常見的惡性腫瘤之一，2002年全球HCC新發(fā)病例數(shù)為62.6萬，而年死亡人數(shù)達59.8萬，死亡人數(shù)與發(fā)病人數(shù)比接近1∶1，預后相當惡劣。中國每年HCC死亡病例數(shù)占全球總數(shù)的55％，HCC死亡率己達20.37/10萬，居國內(nèi)惡性腫瘤死亡率第二位。綜合分析究其原因，其中HCC的高侵襲轉(zhuǎn)移能力是導致其不良預后的關(guān)鍵原因之一。深入探討HCC侵襲轉(zhuǎn)移的分子機制，闡明在侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵作用的基因，有助于發(fā)現(xiàn)新的HCC預后

2、標志物和研制新的有效的抗HCC藥物。我們在先前的臨床實踐中發(fā)現(xiàn)孤立性大肝癌(SLHCC)較結(jié)節(jié)性肝癌(NHCC)有著明顯較低的侵襲轉(zhuǎn)移潛能和較好的預后。在這個非常有意義的臨床發(fā)現(xiàn)的基礎上，我們以SLHCC為切入點對HCC侵襲轉(zhuǎn)移潛能的內(nèi)在分子機制進行了一系列研究。我們采用了基因芯片的技術(shù)分析了在SLHCC和NHCC存在顯著差異表達的基因，發(fā)現(xiàn)Ack1(Activated Cdc42-associated tyrosine kinase1

3、)在NHCC中的表達水平較SLHCC顯著升高，提示其可能為一個與HCC侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因。
　　 Ack1基因定位于人染色體3q29，其編碼蛋白大小約120KD，主要定位于細胞胞漿，其分子結(jié)構(gòu)包括一個激酶區(qū)、一個SH3區(qū)、一個Cdc42/Rac結(jié)合區(qū)和一個富含脯氨酸的羧基端。Ack1蛋白屬于酪氨酸激酶家族，最早作為Cdc42下游的作用蛋白被發(fā)現(xiàn)。已有的研究表明，Ack1作為Cdc42下游的效應器參與了多條信號通路，在細胞增殖、運

4、動和侵襲中發(fā)揮重要作用。盡管如此，Ack1在惡性腫瘤中作用還遠未闡明，其與腫瘤患者的預后關(guān)系及腫瘤的臨床病理特征的關(guān)系尚不清楚，且其在HCC中的作用尚未有研究涉及。基于此，我們在本研究中通過體內(nèi)和體外兩個水平，運用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、小RNA干擾和裸鼠成瘤等實驗方法，對Ack1在HCC侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，以及其可能的分子機制進行了一系列研究，主要結(jié)果如下：
　　 1.我們運用real-time RT-PCR及Western blot方法在檢

5、測了38例手術(shù)切除的新鮮HCC和相應的鄰近非瘤肝組織(ANLT)以及5例正常肝組織(NL)中Ack1 mRNA和蛋白的表達水平。結(jié)果顯示Ack1 mRNA和蛋白均在HCC中明顯高表達(P＜0.05)。免疫組化法檢測了131例HCC石蠟切片中Ack1蛋白的表達強度。結(jié)果顯示Ack1在85.5％(112/131)的HCC中表達，根據(jù)免疫組化的結(jié)果將此131例HCC分為Ack1高表達組和Ack1低表達組并比較兩組患者的預后，結(jié)果顯示Ack1高

6、表達組患者的術(shù)后無瘤生存率(P＜0.05)和總生存率(P＜0.01)皆明顯短于Ack1低表達組。進一步將Ack1蛋白表達水平納入單因素和多因素Cox比例風險回歸模型分析。結(jié)果顯示Ack1的高表達是HCC患者預后的獨立危險因素(RR,1.758;P＝0.029)。繼而我們又進一步分析了Ack1表達水平與HCC不同臨床病理特征之間的關(guān)系，結(jié)果顯示Ack1的表達水平與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)目、細胞分化程度以及有無靜脈浸潤等與HCC侵襲性生長相關(guān)的臨床病理

7、特征密切相關(guān)(P＜0.05)，并且在NHCC中Ack1的表達明顯高于SLHCC。提示Ack1的高表達與HCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，并可能因此而導致了HCC患者的不良預后。
　　 2.RT-PCR及Western blot方法檢測Ack1 mRNA和蛋白在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3這3種侵襲轉(zhuǎn)移潛能依次遞增的HCC細胞系中的表達水平，并以常氏肝細胞系CCL13作為對照。結(jié)果顯示Ack1 mRNA和蛋白在3種HCC細胞

8、系中的表達皆顯著高于CCL13(P＜0.01)，且其表達水平在HepG2、MHCC97-L和HCCLM3細胞中依次升高（任意兩者比較，P＜0.05），提示Ack1的高表達與HCC細胞的侵襲轉(zhuǎn)移潛能密切相關(guān)。
　　 3.為了尋找Ack1參與HCC的生長和侵襲轉(zhuǎn)移的直接證據(jù)，我們接下來采用體內(nèi)實驗進行了驗證。我們選取了侵襲轉(zhuǎn)移潛能相對較低的MHCC97-L細胞，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的方法獲得了過表達Ack1的MHCC97-L細胞系MHCC9

9、7-LAck1，以轉(zhuǎn)染空載體的MHCC97-L細胞系MHCC97-LVector作為對照，并建立了MHCC97-L裸鼠原位HCC生長轉(zhuǎn)移模型，以此觀察過表達Ack1對HCC生長和轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)果顯示MHCC97-LAck1組裸鼠所形成的肝臟原位種植瘤的平均體積較MHCC97-LVector組裸鼠明顯增大(P＜0.05)，且有著更高肝內(nèi)轉(zhuǎn)移率(P＜0.05)和肺轉(zhuǎn)移率(P＜0.01)，提示上調(diào)Ack1的表達促進了HCC在體內(nèi)的生長和轉(zhuǎn)移。

10、
　　 4.為進一步深入研究Ack1在HCC中的作用，解釋我們在體內(nèi)實驗觀察到的Ack1對HCC生長和轉(zhuǎn)移的作用。我們隨后進行了一系列體外細胞學實驗，從細胞的層面來觀察上調(diào)Ack1對HCC細胞惡性生物學行為的作用。生長曲線和平板克隆形成實驗的結(jié)果顯示MHCC97-LAck1細胞較MHCC97-LVector細胞的增殖能力顯著增強，生長速度顯著加快(P＜0.05)；劃痕愈合實驗的結(jié)果顯示MHCC97-LAck1細胞較MHCC97-

11、LVector細胞遷移能力顯著增強(P＜0.01)；基質(zhì)膠侵襲實驗顯示MHCC97-LAck1細胞較MHCC97-LVector細胞的侵襲能力亦顯著增強(P＜0.01)。進一步行細胞骨架(F-actin)熒光染色發(fā)現(xiàn)顯示過表達Ack1以后，MHCC97-L細胞的肌動蛋白細胞骨架發(fā)生明顯形變。這些結(jié)果提示上調(diào)Ack1能夠增強HCC細胞的惡性表型，促進HCC細胞生長增殖、運動和侵襲能力，從而促進HCC的生長和轉(zhuǎn)移。
　　 5.接下來

12、我們進一步研究試圖弄清楚Ack1通過何種分子機制促進HCC細胞的惡性生物學行為。鑒于已有的研究證實Crk在腫瘤運動侵襲中發(fā)揮著重要作用，并且Crk參與了Ack1的同源蛋白Ack2誘導的細胞運動。因此我們推測Crk亦可能參與了Ack1在HCC中的信號通路。我們首先檢測了MHCC97-L細胞中Crk的表達水平，以常肝細胞系CCL13作為對照，結(jié)果顯示Crk在MHCC97-L細胞中存在明顯的表達上調(diào)，提示Crk可能在HCC的發(fā)生和/或發(fā)展發(fā)揮

13、了一定的作用。接下來我們用免疫共沉淀的方法證明了在MHCC97-L中Ack1與Crk存在相互作用。隨后我們利用小RNA干擾的方法阻斷Crk的表達，再重復前面所進行的一系列體內(nèi)和體外實驗，以觀察阻斷Crk對Ack1誘導的HCC細胞增殖、運動、侵襲和轉(zhuǎn)移的影響。體內(nèi)和體外的實驗顯示阻斷Crk對Ack1誘導增強的HCC生長和增殖并無顯著影響(P＞0.05)；而對Ack1誘導增強的HCC運動、侵襲和轉(zhuǎn)移能力皆有明顯抑制作用(P＜0.05)，且進

14、一步研究發(fā)現(xiàn)在Crk被阻斷的情況下，過表達Ack1不能再對HCC的運動、侵襲和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生顯著的促進作用(P＞0.05)，提示Crk參與了Ack1誘導的HCC運動、侵襲和轉(zhuǎn)移的信號通路。
　　 通過以上的研究，我們發(fā)現(xiàn)了Ack1在HCC中表達上調(diào)并且在HCC的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。我們還首次證實了Ack1的高表達與腫瘤患者的不良預后以及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的臨床病理特征密切相關(guān)；并且首次證實了過表達Ack1通過Crk信號通路實現(xiàn)促進肝細