雷帕霉素對人骨肉瘤細胞及干細胞中雷帕霉素靶蛋白傳導通路的生物學作用及意義.pdf

1、目的:研究雷帕霉素對人骨肉瘤 MG-63細胞和骨肉瘤干樣細胞中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）傳導通路的影響，探討雷帕霉素在骨肉瘤聯(lián)合化療中的可行性。
　　方法:體外培養(yǎng)人骨肉瘤MG-63細胞和骨肉瘤干樣細胞，采用免疫熒光技術(shù)檢測骨肉瘤細胞球中 Nanog和 Oct4的表達。以0、20、50和100 nmol/l濃度的雷帕霉素處理骨肉瘤細胞及骨肉瘤干樣細胞觀察檢測對其的生物學特性影響：采用半定量PCR和定量PCR法檢測不同濃度雷帕霉素處

2、理后骨肉瘤干樣細胞和未經(jīng)處理的骨肉瘤細胞中mTOR的表達。細胞存活能力，CCK-8法檢測細胞存活和生長。活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性CCK-8還原為橙黃色甲臜溶解在培養(yǎng)液中，細胞死亡無法還原CCK-8。酶聯(lián)免疫檢測儀測定橙黃色甲臜吸光度值，可反映活細胞數(shù)量。細胞遷移能力，劃痕法測定遷移活性，遷移是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移過程中不可缺少的環(huán)節(jié)，腫瘤遷移需要一定運動能力。高轉(zhuǎn)移腫瘤通常具有較強的運動能力。細胞侵蝕能力，細胞侵襲小室法測定其侵蝕

3、能力，惡性腫瘤細胞有局部侵襲作用及遠處轉(zhuǎn)移作用，惡性腫瘤首先在原發(fā)灶侵襲周圍組織然后進入血液循環(huán)系統(tǒng)或進入淋巴循環(huán)系統(tǒng)出現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移。惡性細胞要依賴腫瘤血管形成作用，即腫瘤血管形成作用導致或增強惡性腫瘤生長以及侵襲。細胞成球能力，顯微鏡觀察、攝片、計數(shù)、觀察經(jīng)不同方法處理的骨肉瘤干細胞再形成骨肉瘤細胞球的能力，從體外水平闡明mTOR信號通路對維持骨肉瘤干細胞狀態(tài)的重要性。
　　結(jié)果:熒光顯微鏡下可見，骨肉瘤MG-63細胞球較致密的核

4、心部分Nanog和Oct4呈陽性表達，提示成球的骨肉瘤細胞球有干細胞特性。半定量PCR檢測結(jié)果顯示，未經(jīng)雷帕霉素處理的骨肉瘤干樣細胞中mTOR mRNA的相對表達量，明顯高于人骨肉瘤 MG-63細胞。定量 PCR檢測結(jié)果顯示，100 nmol/l雷帕霉素處理組骨肉瘤干樣細胞中 mTOR mRNA的表達量，明顯低于0 nmol/l雷帕霉素處理組。CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與0 nmol/l雷帕霉素處理組比較，20、50、70和100 nm

5、ol/l雷帕霉素處理組人骨肉瘤 MG-63細胞的增殖均受到明顯抑制；20、50和70 nmol/l雷帕霉素對骨肉瘤干樣細胞的增殖無明顯的抑制作用，但100 nmol/l雷帕霉素對骨肉瘤干樣細胞的增殖有明顯的抑制作用。形態(tài)學觀察結(jié)果顯示，雷帕霉素可以有效抑制骨肉瘤干樣細胞的成球特性。雷帕霉素處理骨肉瘤細胞后細胞遷移能力明顯受限，未經(jīng)雷帕霉素處理的骨肉瘤干樣細胞侵襲能力強于骨肉瘤細胞，70和100 nmol/l雷帕霉素處理組骨肉瘤干樣細胞可