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文檔簡介
1、目的:神經(jīng)絲蛋白是神經(jīng)細胞重要的骨架蛋白,由NF-L、NF-M和NF-H三個亞基組成,在維持細胞骨架、穩(wěn)定細胞形態(tài)和軸突轉運方面有十分重要作用。過度磷酸化的神經(jīng)絲是AD腦中NFT的一種主要成分和早期的病理改變,影響神經(jīng)細胞的軸突轉運功能。糖基化是蛋白質的另一種重要的翻譯后修飾方式。與磷酸化的性質相似,修飾同一蛋白質的相同或鄰近絲氨酸或者蘇氨酸的羥基,可能存在相互調節(jié)。研究表明:AD腦神經(jīng)絲蛋白的糖基化修飾水平降低,伴隨著磷酸化修飾水平增
2、加,其機制目前尚不清楚。本實驗在細胞水平探討神經(jīng)絲蛋白糖基化修飾水平的改變能否調節(jié)磷酸化和軸突轉運的功能,闡明神經(jīng)絲蛋白的糖基化在AD發(fā)病機制中的作用,為AD的防治提供新的思路。方法:我們采用不同藥物通過不同機制干預SK-N-SH細胞的糖基化;采用MTT方法篩選合適的藥物濃度和對細胞活性的影響;采用蛋白免疫印跡和細胞免疫熒光化學方法觀察神經(jīng)絲蛋白糖基化和磷酸化的改變,用PI/Hoechst和DAPI染色觀察細胞的死亡方式;同時,我們采用
3、GFP-NFM轉染細胞,熒光標記神經(jīng)絲蛋白,熒光漂白恢復技術觀察糖基化的改變對神經(jīng)絲蛋白軸突轉運功能的影響。結果:與對照組相比,Alloxan處理細胞誘導細胞活性減低,神經(jīng)絲蛋白過度磷酸化且過度磷酸化的神經(jīng)絲在胞體異常聚集,而糖基化水平降低;用20μMNAG-Ae預處理12小時細胞不影響細胞的活性,提高細胞的糖基化水平,減少Alloxan誘導的細胞過度磷酸化和聚集;Alloxan誘導的細胞死亡包括程序性凋亡和繼發(fā)性壞死,而20μMNAG
4、-Ae預處理12小時可以保護Alloxan誘導的細胞凋亡和壞死;Alloxan處理細胞細胞熒光漂白后恢復速度減慢,而20μMNAG-Ae處理細胞細胞熒光漂白后恢復速度增快。DON處理細胞,細胞神經(jīng)絲蛋白糖基化水平降低,過度磷酸化且過度磷酸化的神經(jīng)絲蛋白在胞體異常聚集,熒光漂白后恢復速度減慢。結論:減低細胞的糖基化能夠誘導AD樣神經(jīng)細胞的過度磷酸化和細胞活性下降,影響神經(jīng)絲蛋白軸突轉運功能,而增加細胞糖基化能夠改善細胞磷酸化,有力地保護神
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