半乳甘露聚糖與1，3-β-D葡聚糖在侵襲性煙曲霉菌感染診斷的實(shí)驗(yàn)及臨床研究.pdf

1、研究目的：
　　 探討侵襲性肺部曲霉菌感染大鼠模型制作方法,評價(jià)血液、肺泡灌洗液(Broncho-alveolar Lavage Fluid,BALF)和痰液標(biāo)本半乳甘露聚糖(Galactomannan,GM)和1,3-β-D葡聚糖((1,3)-beta-D-glucan,BG)檢測對侵襲性曲霉病(Invasive aspergillosis,IA)的診斷價(jià)值。
　　 研究方法
　　 1.建立SD大鼠侵襲性肺曲霉

2、菌感染模型
　　 實(shí)驗(yàn)分組:雌性SD大鼠72只,隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)A1、A3、A5組(分別代表接種后第1天(day,d),第3d,第5d處死采樣,和正常對照組B組、免疫抑制對照組C組、接種對照組D組,每組各12只。
　　 免疫抑制及感染模型的建立:實(shí)驗(yàn)A1、A3、A5組和免疫抑制對照組分別給予每只大鼠肌肉注射地塞米松0.6mg/kg,環(huán)磷酰胺75mg/kg,連續(xù)3d。免疫抑制第3d,給予實(shí)驗(yàn)A1、A3、A5組及接種對照D組雙側(cè)

3、鼻孔滴入煙曲霉孢子懸液,每只300～400ul,每天1次,連續(xù)2d,對照組B組和C組滴入等量的無菌生理鹽水。
　　 血漿、BALF及肺臟標(biāo)本的采集及處理:實(shí)驗(yàn)組接種完成后第1、3、5d分批心臟采血處死大鼠,對照組B、C、D于第5d處死,收集大鼠血清和BALF標(biāo)本,離心處理后-80℃保存?zhèn)溆?。無菌操作下,手術(shù)切取大鼠的肺臟,切取部分臟器組織制成勻漿,接種于沙氏平板上培養(yǎng)。其余內(nèi)臟組織塊放入4％多聚甲醛溶液中固定8小時(shí)以上,石蠟包埋

4、,進(jìn)行蘇木素-伊紅染色,六胺銀染色及免疫組化處理。免疫抑制感染各組分別取一份肺臟組織2％磷酸鹽戊二醛固定過夜后,行掃描電鏡觀察。
　　 2.臨床標(biāo)本的收集
　　 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)診斷標(biāo)準(zhǔn),把侵袋性真菌感染(Invasive fungalinfection,IFI)病人分為確診、臨床珍斷及擬診3個(gè)級別。依據(jù)此臨床診斷標(biāo)準(zhǔn),排除IFI病人作為對照組,收集南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院自2008年9月至2009年11月的臨床住院病人的血液

5、、BALF和痰液標(biāo)本。
　　 3 標(biāo)本的檢測
　　 收集大鼠模型的血液及BALF標(biāo)本,以病理學(xué)為標(biāo)準(zhǔn),按照試劑盒操作要求,用法國伯樂公司生產(chǎn)的Platelia Aspergillus試劑盒和美國ACC公司生產(chǎn)的Glucatell試劑盒檢測兩種標(biāo)本的GM和BG含量。同時(shí)對收集的臨床侵襲性曲霉菌感染病人血液、BALF和痰液標(biāo)本,用同樣方法檢測兩者GM和BG的水平。
　　 研究結(jié)果
　　 1.動(dòng)物試驗(yàn)中36例實(shí)

6、驗(yàn)組老鼠均被病理學(xué)證實(shí)存在肺煙曲霉菌感染。GM實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d血液GM敏感性分別為58.30％,66.67％,83.33％,平均敏感性為69.44％；實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d肺泡灌洗液GM敏感性分別為66.67％,91.67％,100.00％,平均敏感性為86.11％。兩種標(biāo)本GM檢測特異性均為100％。各對照組BALF及血液GM檢測均為陰性。實(shí)驗(yàn)組血漿、BALF的GM實(shí)驗(yàn)敏感性、特異性與對照組間差異有統(tǒng)計(jì)

7、學(xué)意義(P<0.005)。實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d BALF檢測GM均值呈升高趨勢。實(shí)驗(yàn)組相同感染天數(shù)大鼠BALF GM檢測值明顯高于血液組(配對t檢驗(yàn),P<0.05)。
　　 G實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果為:實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d血液G實(shí)驗(yàn)敏感性分別為58.33％,75％,75％,平均敏感性為69.44％；實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d BALF標(biāo)本G實(shí)驗(yàn)敏感性分別為75％,83.33％,83.33％,平均敏感性為80.56％。特異

8、性分別為94.44％,100％。實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d的平均血液BG濃度均大于20 pg/ml；三個(gè)對照組最終血液BG濃度均小于20pg/ml,實(shí)驗(yàn)各組血液BG濃度與對照組比較均有顯著性差異(單因素方差分析,P<0.001).實(shí)驗(yàn)組感染后1d、3d、5d大鼠BALF標(biāo)本BG濃度均大于20 pg/ml；三個(gè)對照組最終血液BG濃度均小于20pg/ml.實(shí)驗(yàn)各組BALF的BG濃度與對照組比較均有顯著性差異(單因素方差分析,P<0.001

9、)。
　　 2.臨床病人檢測結(jié)果:本研究共收集血液和BALF、痰液病例標(biāo)本各55例,其中確診病人標(biāo)本2例,均為病理確診曲霉菌病人；臨床診斷標(biāo)本27例；擬診病人標(biāo)本16例；正常對照組病例標(biāo)本10例。GM檢測結(jié)果:血液GM檢測確診病例、臨床診斷病例、擬診病例GM均值均大于1.5,正常對照病例GM均值小于1.5。病例組GM值與對照組兩兩比較,除擬診組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(單因素方差分析,P>0.05),其余各組均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(單因素方差

10、分析,P<0.05),多重比較分析臨床診斷組和擬診組與確診組比較間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(DunnettT3,P<0.05),臨床診斷組與擬診組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Dunnett T3,P>0.05)。BALF、痰液GM檢測確診病例、臨床診斷病例、擬診病例GM均值均大于1.5,正常對照病例GM均值小于1.5。病例各組與正常對照組均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(單因素方差分析,P<0.05),多重比較分析各組兩兩之間間有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(Dunnett T3,

11、P<0.05)。血液標(biāo)本組敏感性為77.78％,特異性為70％,陽性預(yù)測值為92.11％,陰性預(yù)測值為41.18％。BALF、痰液標(biāo)本組敏感性為84.44％,特異度為80％,陽性預(yù)測值95％,陰性預(yù)測值為41.18％。
　　 臨床病人BG檢測結(jié)果:血液BG檢測確診病例、臨床診斷病例、擬診病例BG濃度均值均大于20pg/ml,正常對照病例BG濃度均值小于20 pg/ml。病例各組BG濃度與對照病例組兩兩比較,各組均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

12、(單因素方差分析,P<0.05),各病例組間BG濃度差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(多重比較,P<0.05)。BALF、痰液檢測確診病例、臨床診斷病例、擬診病例BG濃度均值均大于20pg/ml,正常對照病例BG濃度均值小于20 pg/ml。病例各組與對照病例組比較均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(LSD法,P<0.05),各病例組問BG濃度差異也具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(LSD法,P<0.05)。血清標(biāo)本組敏感性為77.78％,特異性為70％,陽性預(yù)測值為92.11％,

13、陰性預(yù)測值為41.18％。BALF、痰液標(biāo)本組敏感性為82.22％,特異性為90％,陽性預(yù)測值為97.37％,陰性預(yù)測值為52.94％。
　　 結(jié)論
　　 1、曲霉菌是深部真菌感染的常見致病菌,其致病性很強(qiáng)。
　　 2、GM和BG檢測是診斷深部真菌感染的可靠方法,適用于診斷曲霉菌的深部感染,具有較高的敏感性和特異性。
　　 3、BALF、痰液GM和BG測定方法診斷曲霉菌的深部感染具有較高的敏感性和特異性,