擬南芥幼苗的超低溫保存及其遺傳變異研究.pdf

1、本研究以模式植物擬南芥(Arabidopsis thaliana)為材料，對(duì)其幼苗的玻璃化法超低溫保存條件進(jìn)行了進(jìn)一步優(yōu)化，并通過(guò)形態(tài)觀察和分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)超低溫保存處理前后材料的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行了比較研究。主要研究結(jié)果如下： 1.進(jìn)一步優(yōu)化了擬南芥幼苗玻璃化法超低溫保存的程序，成活率可達(dá)92﹪以上。萌發(fā)1～2 d的幼苗室溫下預(yù)處理(2 mol/L甘油+0.4 mol/L蔗糖)20 min，然后，換成玻璃化保護(hù)液PVS2(30﹪甘油

2、+15﹪DMSO+15﹪乙二醇+0.4mol/L蔗糖的MS培養(yǎng)基)于冰水混合物中處理50～60 min，立即投進(jìn)液氮中保存，恢復(fù)時(shí)，先在40℃水浴中迅速化凍(不斷搖晃)，接著用洗滌液(含1.2 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基)洗滌20～30 min，每10 min換一次洗滌液，最后轉(zhuǎn)接到新的MS培養(yǎng)基上置入溫室培養(yǎng)。5 d后統(tǒng)計(jì)成活率，10 d后移栽到培養(yǎng)土(蛭石：營(yíng)養(yǎng)土=1：1)中培養(yǎng)，60 d后收獲種子。 2.對(duì)超低溫保存處

3、理的苗和對(duì)照的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)行形態(tài)觀察比較。所有處理過(guò)的苗(包括在液氮中冷凍過(guò)的和未冷凍的)在恢復(fù)處理兩天內(nèi)生長(zhǎng)都很緩慢，而對(duì)照組幼苗則生長(zhǎng)很快。經(jīng)過(guò)超低溫保存處理但未經(jīng)受液氮冷凍和化凍的幼苗幾乎全部成活(達(dá)98﹪)，而那些經(jīng)過(guò)完整超低溫保存處理的幼苗，化凍恢復(fù)后成活率下降到93.8﹪。前20 d，對(duì)照組的苗與兩個(gè)處理組的苗相比生長(zhǎng)較快，隨后差異減小，至抽薹期三組樣品的植株形態(tài)大小基本一致，均正常開花、結(jié)實(shí)。 3.應(yīng)用擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多

4、態(tài)性(AFLP)技術(shù)對(duì)處理過(guò)的及對(duì)照組的幼苗基因組DNA進(jìn)行分析。EcoR Ⅰ和Mse Ⅰ對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，用7對(duì)引物組合共擴(kuò)增出549條帶，在3組樣品間未發(fā)現(xiàn)有差異片段出現(xiàn)。表明在超低溫保存處理過(guò)程中沒(méi)有造成保存材料基因組DNA序列的變化。 4.運(yùn)用甲基敏感擴(kuò)增多態(tài)性(MSAP)標(biāo)記分析了處理樣品與對(duì)照組樣品間及其第二代的甲基化水平情況。Msp Ⅰ和Hap Ⅱ分別與EcoR Ⅰ結(jié)合對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切，在擴(kuò)增的66