CARMA3在膀胱癌中的表達及作用機制研究.pdf

1、前言
　　膀胱癌是泌尿外科臨床上最常見的腫瘤，在我國，男性膀胱癌發(fā)病率位于全國惡性腫瘤的第七位，女性排在第十位以后。約90％的膀胱癌為尿路上皮癌，其中約70％為非肌層浸潤性膀胱癌，預后好，但術(shù)后約10％-15％進展為肌層浸潤性膀胱癌。而浸潤性膀胱癌惡性程度較高，常浸潤肌層，預后較差。因此，尋找治療膀胱癌的有效方法，已成為膀胱癌研究領(lǐng)域的熱點。
　　Caspase募集域和膜相關(guān)鳥苷酸激酶樣結(jié)構(gòu)域蛋白(CARMA)家族是一種支架

2、蛋白，含有CARMA1，CARMA2，CARMA3三個成員。最近的研究表明，CARMA3在G蛋白偶聯(lián)受體和PKC誘導的NF-κB活化中發(fā)揮重要作用。CARMA3能夠通過招募BCL10、MALT1和TRAF6，誘導NF-κB活化，調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應，促進腫瘤細胞生存、抑制腫瘤細胞凋亡，引起腫瘤惡性進展。在乳腺癌，肺癌，腎癌和結(jié)直腸癌中都發(fā)現(xiàn)了CARMA3的致癌作用。但到目前為止，CARMA3在膀胱癌中的作用及其生物學機制尚不清楚。

3、　　本研究旨在檢測CARMA3在膀胱癌組織及細胞系中的表達，探討CARMA3在膀胱癌發(fā)生發(fā)展中的作用機制，為進一步的研究奠定基礎，進而為膀胱腫瘤的診斷和治療提供了新的靶點，也為膀胱癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移機制研究提供了新的視角。
　　方法
　　1、免疫組化方法檢測CARMA3在膀胱癌組織及癌旁組織中的表達情況。
　　收集90位膀胱癌患者標本，用免疫組織化學法檢測膀胱癌和癌旁組織中的CARMA3的表達情況。
　　2、Weste

4、rnBlot和Real-timeRT-PCR方法檢測細胞系中CARMA3蛋白和mRNA的表達水平。
　　培養(yǎng)人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1及膀胱癌細胞系BIU87，T24，5637共四種細胞，用WesternBlot和Real-timeRT-PCR方法檢測CARMA3蛋白和mRNA的表達水平。
　　3、應用siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24細胞系，應用WesternBlot及Real-timeRT-PCR檢測沉默效率。

5、r>　　瞬時轉(zhuǎn)染膀胱癌細胞系5637和T24，實驗設轉(zhuǎn)染組及陰性對照組，轉(zhuǎn)染方法和步驟參照脂質(zhì)體說明書進行。轉(zhuǎn)染48小時后收集細胞，提取總RNA，總蛋白，采用WesternBlot和Real-timeRT-PCR方法檢驗轉(zhuǎn)染效率。
　　4、CCK-8試劑盒和克隆形成實驗檢測轉(zhuǎn)染后5637和T24細胞的增殖能力和克隆形成能力。
　　5、應用WesternBlot檢測沉默CARMA3后膀胱癌細胞中IκB，CyclinD1和Bcl

6、-2的蛋白表達變化，應用Real-timeRT-PCR檢測沉默CARMA3后膀胱癌細胞中CyclinD1和Bcl-2的mRNA的變化。
　　6、熒光素酶報告基因檢測沉默CARMA3后NF-κB的活性改變。
　　結(jié)果
　　1、CARMA3在膀胱癌組織中的表達情況。
　　(1)38.8％(35/90)膀胱癌組織表達CARMA3。
　　(2)CARMA3主要定位于細胞漿中。
　　(3)CARMA3的表達與膀

7、胱癌的分期(Ta-T1vsT2-T4，P=0.081)相關(guān)
　　(4)CARMA3的表達與膀胱癌的病理分級(G1vsG2-G3，P=0.027)有關(guān)
　　2、CARMA3在細胞系中的表達情況。
　　(1)人膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1低表達CARMA3蛋白及mRNA。
　　(2)膀胱癌細胞系5637和T24高表達CARMA3蛋白和mRNA。
　　3、應用siRNA轉(zhuǎn)染5637和T24后的沉默效率。

8、r>　　轉(zhuǎn)染siRNA48小時后，5637和T24細胞CARMA3蛋白及mRNA水平明顯低于陰性對照組。
　　4、轉(zhuǎn)染CARMA3后對膀胱癌細胞的增殖能力和克隆形成能力的影響。
　　(1)沉默CARMA3的5637和T24細胞的增殖能力明顯低于轉(zhuǎn)染對照組。
　　(2)沉默CARMA3的5637和T24細胞的克隆形成能力明顯低于對照組。
　　5、沉默CARMA3后膀胱癌細胞中IκB蛋白的表達變化，CyclinD1和

9、Bcl-2蛋白及mRNA的表達變化。
　　(1)沉默CARMA3明顯降低了p-IκB蛋白的表達，總IκB蛋白無明顯變化。
　　(2)沉默CARMA3明顯降低了CyclinD1及Bcl-2蛋白及mRNA的水平。
　　6、熒光素酶報告基因檢測沉默CARMA3后NF-κB的活性改變。沉默CARMA3降低了NF-κB的活性
　　結(jié)論
　　CARMA3通過激活NF-κB信號傳導通路促進了膀胱癌細胞的生長。CARMA3