強化表達VEGF的老年人骨髓基質(zhì)細胞治療腦缺血的實驗研究.pdf

1、一、研究背景：
　　 腦血管病是嚴重危害人類健康的三大致死疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率、高死亡率和高復發(fā)率等特點，給家庭和社會帶來了極大的負擔。在腦血管疾病中，缺血性腦血管病占了80％左右。然而，迄今為止只有重組組織血纖維蛋白溶酶原激活物(rt-PA)一種藥物獲得了FDA的批準用于急性腦缺血的治療。但rt-PA介入溶栓治療有嚴格的時間限制（必須在卒中發(fā)生6小時內(nèi)應用），而且大劑量使用rt-PA也增加了發(fā)生腦出血的危險性。因此

2、，如何促進腦缺血后有效的組織和功能修復是當前研究的熱點，但也是難點，而干細胞移植是近年來興起的具有良好的臨床應用前途的治療腦缺血的新方法之一。
　　 BMSCs是源于骨髓的一種多潛能成體干細胞，其應用于細胞治療的主要優(yōu)勢在于其可以自體移植，因而不存在胚胎干細胞移植所存在的免疫排斥、倫理學及致瘤性等方面的限制。而且骨髓源成體干細胞取材相對簡單，不像神經(jīng)干細胞主要位于腦室下帶、海馬等腦深部結(jié)構(gòu)中，損傷風險性大、獲得困難、細胞來源有限

3、。BMSCs移植治療已經(jīng)應用于腦缺血動物實驗及臨床試驗性治療。
　　 BMSCs移植治療腦缺血的方法較多，包括通過靜脈途徑、動脈途徑或腦內(nèi)局部注射移植，用于BMSCs治療大鼠大腦中動脈阻斷模型(MCAO)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)移植的細胞能定向向缺血灶周圍遷徙，參與損傷修復，并促進神經(jīng)功能的恢復。由于BMSCs具有分化成神經(jīng)細胞的能力，利用移植的BMSCs發(fā)揮細胞替代作用重建神經(jīng)環(huán)路是最直接的治療方法。然而，大部分的研究發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs只

4、有相當少的一部分表達神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細胞的表面標志，而即使這些少量的表達神經(jīng)組織標志的細胞，目前也沒有電生理的或其他方面的證據(jù)顯示它們具有神經(jīng)細胞的功能，更無法確定它們是否同其他的神經(jīng)細胞建立了聯(lián)系。
　　 目前的研究顯示，BMSCs的起效機制是多方面的，如:減少缺血半影區(qū)細胞凋亡、促進內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖、促進缺皿區(qū)新血管再生、抑制膠質(zhì)瘢痕增生以及促進軸突再生等。歸結(jié)起來，BMSCs治療腦缺血的機制主要的并不是其替代了缺失的

5、神經(jīng)元，而是其在腦內(nèi)缺血的微環(huán)境的刺激下，發(fā)揮了“分子工廠”的作用，分泌各種營養(yǎng)因子，介導了以上的治療作用。
　　 BMSCs在骨髓中的數(shù)量稀少，因此在應用于細胞移植治療時必須進行體外擴增以獲得足夠多的細胞。然而，BMSCs同大多數(shù)的成體細胞一樣，會發(fā)生衰老，主要表現(xiàn)在兩個方面:①隨年齡增長，BMSCs的數(shù)量和質(zhì)量均有明顯下降，而老年人正是腦缺血的高發(fā)人群，是可能的需要細胞移植治療的主體;②BMSCs在體外傳代過程中，細胞形態(tài)會

6、逐漸發(fā)生變化，由細梭形變成寬扁平狀，細胞的增殖能力、分化潛力、乃至向病灶區(qū)歸巢的能力均會逐漸喪失。因此，如果沒有采取特殊的處理方法對BMSCs進行改造，只是在體外充分擴增BMSCs再回輸回病人體內(nèi)，實際上已經(jīng)大大縮短了BMSCs的壽命，也嚴重影響了治療的效果。
　　 既往對BMSCs發(fā)生衰老的機制研究表明，BMSCs不表達端粒酶是一個很重要的原因。因此為了延長BMSC的壽命甚至使之永生化，近幾年來，有多家實驗室采用的是hTERT

7、基因轉(zhuǎn)染的方法，并成功獲得BMSCs永生細胞系。此法建立的細胞系在體外長期培養(yǎng)擴增中端粒長度沒有明顯縮短，保持了同原代BMSCs相似甚至更好的增殖及多向分化潛能。更為重要的是，用hTERT轉(zhuǎn)染建立的BMSCs細胞系在體外長期培養(yǎng)后仍保持了正常的染色體組型，細胞的生長存在接觸抑制，體內(nèi)、體外實驗均沒有明顯的致瘤性。這是我們選擇hTERT作為修飾改造BMSCs的基因之一的原因。
　　 此外，通過神經(jīng)干細胞移植或神經(jīng)營養(yǎng)因子來促進受損

8、的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的修復是腦缺血治療的有效策略，但我們注意到，在缺血缺氧的微環(huán)境中，干細胞的成活十分困難，增殖和分化能力明顯減弱，難于發(fā)揮治療作用。血供的恢復是神經(jīng)修復的基礎(chǔ)，而VEGF是已知的胚胎發(fā)育期血管發(fā)生及成體后血管再生的最關(guān)鍵因子，VEGF對于腦缺血的治療作用已有較多文獻報道，因此我們又選定了VEGF作為改造BMSCs的另一個基因。
　　 既往對于老年的BMSCs的研究較少，對其進行雙基因改造的研究更是乏見，近年有研究表明，V

9、EGF和hTERT兩者之間有難得的協(xié)同增強效應，這也是對我們這一探索性研究意義的一個側(cè)面的肯定。
　　 二.研究目的：
　　 骨髓基質(zhì)細胞(BMSCs)移植是治療腦缺血的一個有效策略，然而，BMSCs隨年齡增長以及在體外擴增過程中會發(fā)生衰老，這阻礙了它的治療應用。本研究擬以人端粒酶催化亞單位（hTERT）和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEGF)慢病毒表達載體雙基因聯(lián)合修飾老年人的BMSCs，探索構(gòu)建強化表達VEGF的永生化BM

10、SCs系，檢測其生物學特征，并以改造后的BMSCs治療大鼠腦缺血/再灌注模型，檢測治療效果，探討治療機制。在實驗過程中，與未經(jīng)修飾的BMSCs及hTERT或VEGF單基因修飾的BMSCs進行對比研究。由于BMSCs含有自體的遺傳信息，研究成果將有助于探索制備個體化的(patient-specific)、針對腦缺血治療的(disease-specific)干細胞產(chǎn)品，也會為進一步的實驗研究打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 三.材料和方法

11、r>　　 1、老年人骨髓基質(zhì)細胞hBMSC的分離、培養(yǎng)與鑒定:采用本實驗室已建立的全血細胞貼壁培養(yǎng)的方法，取正常成年人骨髓，年齡在50歲以上，1∶1～1∶2加入含有20％ FBS血清的DMEM low glucose培養(yǎng)基（含1％雙抗），48小時后半量換液，小心去除上層懸浮紅細胞，勿晃動下層貼壁細胞，隨后繼續(xù)培養(yǎng)。72小時候再次半量換液，并于倒置顯微鏡下觀察，可見貼壁細胞，隨后3～4天正常全量換液，去除多余的不貼壁細胞，一般15天左右

12、可長滿，為原代hBMSCs。隨后用0.05％的胰酶消化，1∶2傳代，多次傳代后去除可能的成纖維細胞。
　　 2、實驗分組:將實驗細胞分為以下5組:①未轉(zhuǎn)染組(hBMSC);②空病毒組(vehicle)③VEGF轉(zhuǎn)染組(hBMSC-VEGF)，應用慢病毒載體攜帶VEGF165基因以最佳感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI)=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs;④TERT轉(zhuǎn)染組(hBMSC-TERT):應用慢病毒

13、載體攜帶hTERT基因以感染復數(shù)MOI=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs;⑤雙病毒轉(zhuǎn)染組(hBMSC-V&T):慢病毒載體攜帶VEGF和hTERT依次以感染復數(shù)MOI=5體外轉(zhuǎn)染hBMSCs。
　　 3、細胞表型特征:流式細胞儀檢測各組細胞表面標志。
　　 4、體外管狀結(jié)構(gòu)形成:檢測細胞接種在Matrigel Matrix（基底膜基質(zhì)）上，觀察細胞形成毛細胞血管狀結(jié)構(gòu)的能力。
　　 5、裸鼠體內(nèi)成血管能力測試:將各組細胞移

14、植入裸鼠皮下三周后檢測其在裸鼠體內(nèi)形成血管的能力。
　　 6、移植細胞治療短暫腦缺血模型(tMCAO)大鼠，對其有效性做行為學、組織學、細胞學以及蛋白學等多水平的觀察檢測，并試圖揭示其可能的機制。
　　 7、對細胞移植的模型鼠行CatWalk行為學綜合評價，以期找到最適合的指標，并評價治療的效果。
　　 8、取移植細胞的模型大鼠腦組織，研究移植細胞在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸及其對缺血大腦分泌細胞因子的影響。
　　 9、

15、所有原始數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準誤((X)±SE)表示，采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理。造模后各組大鼠各時間點的數(shù)據(jù)比較用重復測量的方差分析，單個時間點間數(shù)據(jù)比較用one-way ANOVA分析，組間的多重比較采用LSD檢驗法，如果數(shù)據(jù)方差不齊，則采用welch法進行多組均數(shù)的比較，組間多重比較采用Tamhane's T2法;以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　 四.結(jié)果
　　 1、本課題組前期實驗已驗證慢病毒對細胞的轉(zhuǎn)染

16、是成功有效的，細胞的壽命得到顯著延長，細胞對端粒酶和VEGF的表達顯著增加，并沒有明顯的致瘤性。
　　 2、在前期實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，我們進一步的實驗表明，VEGF和hTERT的轉(zhuǎn)染能顯著增強hBMSCs的體外成血管能力。
　　 3、免疫熒光結(jié)果顯示Dil標記的移植細胞增加了裸鼠體內(nèi)表達vWF的血管狀結(jié)構(gòu)的形成，并整合進了這種新生的血管樣結(jié)構(gòu)。統(tǒng)計結(jié)果顯示，VEGF或\和TERT的轉(zhuǎn)染能顯著提高hBMSC移植后在裸鼠體內(nèi)形

17、成血管樣結(jié)構(gòu)的密度和周長。
　　 4、大鼠移植hBMSC后，神經(jīng)功能評分皆有好轉(zhuǎn)，移植組與對照組的差異早期并不是非常顯著，但到第7天開始在hBMSC-V(6.5±0.18)和hBMSC-V&T(6.9±0.24)組與對照組(7.6±0.26)見可見顯著性差異，并在隨后的14天和28天兩個時間點移植細胞干預的三組與對照組均出現(xiàn)了顯著性的差異。
　　 5、TTC染色結(jié)果表明，hBMSC的移植對大鼠的梗死區(qū)域有減小作用，而其中

18、hBMSC-V&T和hBMSC-V組的效果最明顯。
　　 6、對大鼠缺血損傷側(cè)的左前肢壓強結(jié)果分析，各組大鼠28天的左前肢壓強有一定程度的恢復，但是在各組間比較，移植hBMSC-V，hBMSC-T和hBMSC-V&T細胞的三組大鼠左前肢壓強恢復更顯著，與對照組比較有顯著性差異，并且V&T組恢復的程度最大。
　　 7、對各組大鼠缺血28天后大鼠的四肢最大接觸面積結(jié)果分析，移植BMSC-V，hBMSC-T和hBMSC-V&T

19、細胞的三組大鼠四肢最大接觸面積較僅移植hBMSC的對照組有顯著增大。
　　 8、模型組大鼠運動速度在造模后第1、3、7、14、28天均比對照組明顯減慢，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而步調(diào)改變?yōu)橐贿^性，模型組大鼠造模后第1、3、7天與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，第14、28天與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 9、MRI成像結(jié)果基本同TTC染色結(jié)果較一致，各組間存在差異，28天時h

20、BMSC-V&T組的腦梗死灶最小，恢復的程度最大，為153.5±8.45mm3，hBMSC-V組為174.6±6.80 mm3，hBMSC-T組為183.1±10.17 mm3，而hBMSC對照組為242.3±9.85 mm3。
　　 10、模型鼠腦組織切片顯示移植細胞主要分布在缺血半影區(qū)，沿缺血灶周邊分布，觀察終點時仍有較強的熒光表達。
　　 11、基因檢測結(jié)果表明，模型鼠腦組織的VEGF(人和大鼠)、hTERT(人)

21、、突觸素P38表達均增加，CD31染色表明細胞整合進新生的血管，且較對照組血管數(shù)目和密度都有增加。
　　 五.結(jié)論
　　 1、hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強化表達VEGF的BMSCs細胞系是可行的，安全有效的，具有重要的臨床價值。
　　 2、大鼠短暫腦缺血模型驗證聯(lián)合修飾的細胞對大鼠的治療效果顯著，神經(jīng)功能恢復較對照組有明顯改善。
　　 3、強化表達VEG