禽多殺性巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫(kù)的構(gòu)建、免疫檢測(cè)及ptfa基因的原核表達(dá).pdf_第1頁(yè)
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1、禽多殺性巴氏桿菌病,又稱(chēng)禽出血性敗血癥或者禽霍亂(fowl cholera),是由多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)引起的一種接觸性、敗血性傳染病,可感染雞、鴨、鵝、鵪鶉和火雞等禽類(lèi)。該病的發(fā)病率和死亡率均很高,具有突發(fā)性和流行的特點(diǎn),給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該病具發(fā)病周期短死亡率高不易治療特點(diǎn),被列為重點(diǎn)防治的家禽疫病之一,預(yù)防和控制本病的流行已刻不容緩。疫苗接種成為巴氏桿菌病的有效措施,多年來(lái)國(guó)內(nèi)

2、外學(xué)者一直都很重視對(duì)該病預(yù)防和控制的研究,研制高效的疫苗已成為研究熱點(diǎn)。近年來(lái),所研究的禽多殺性巴氏桿菌抗原,主要有莢膜、菌毛、脂多糖和外膜蛋白,然而每種抗原所提供的保護(hù)力是有限的。高效的禽多殺性巴氏桿菌病疫苗應(yīng)該使疫苗中盡可能多的包含多種特征性重組抗原。本研究構(gòu)建出禽多殺性巴氏桿菌基因組表達(dá)文庫(kù),以其免疫小鼠,篩選出具有免疫保護(hù)性抗原基因,為新型疫苗的研制奠定基礎(chǔ),并從所獲得的具有保護(hù)性抗原的基因文庫(kù)中提取單個(gè)片段的基因,對(duì)其進(jìn)行原核

3、表達(dá)分析,為進(jìn)一步開(kāi)展深入的疫苗研制工作作了鋪墊。
  本研究以禽多殺性巴氏桿菌CVCC474菌株作為研究對(duì)象,提取該菌的基因組,采用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ進(jìn)行酶切,將其酶切成500-3000bp的DNA片段,將其插入到真核表載體的BamHⅠ酶切位點(diǎn),轉(zhuǎn)化人腸桿菌DH5a宿主,構(gòu)建出5個(gè)DNA表達(dá)子文庫(kù),文庫(kù)總?cè)萘繛?05個(gè)克隆。分別提取5個(gè)文庫(kù)的重組質(zhì)粒,純化后將其溶解于PBS緩沖液,獲得重組質(zhì)粒;將105只6周齡純系雌性小白

4、鼠隨機(jī)分配為7組,每組15只。1-5組分別為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)設(shè)空載體pcDNA3.1(+)組和PBS對(duì)照組。其中1-5組實(shí)驗(yàn)組分別免疫接種禽多殺性巴氏桿菌子文庫(kù)1-5所提取的重組質(zhì)粒,該重組質(zhì)粒用滅菌的1×PBS(pH7.2)稀釋?zhuān)錆舛葹?00μg/μL,pcDNA3.1(+)組接種用用滅菌的1×PBS(pH7.2)稀釋?zhuān)瑵舛葹?00μg/μL的質(zhì)粒pcDNA3.1(+);PBS組接種1×PBS(pH7.2)。每只小鼠每次免疫劑量為100

5、μL,采取雙側(cè)脛前肌注射,自第一次免疫開(kāi)始每隔2周免疫一次,共免疫3次。然后通過(guò)對(duì)各免疫組小鼠的血清特異性抗體、細(xì)胞免疫應(yīng)答和相對(duì)保護(hù)率的檢測(cè),來(lái)篩選確定免疫效果較好的組,篩選含有保護(hù)性抗原基因的子文庫(kù),結(jié)果篩選出基因組表達(dá)子文庫(kù)1為免疫效果較好的文庫(kù),證明文庫(kù)中含有保護(hù)性基因,為進(jìn)一步篩選保護(hù)性抗原基因打下基礎(chǔ),有助于從分子水平上認(rèn)識(shí)禽多殺性巴氏桿菌和尋找禽霍亂病的新的基因。同時(shí)研制出預(yù)防禽多殺性巴氏桿菌病的廉價(jià)、高效疫苗打下基礎(chǔ)。然

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