馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離及其功能分析.pdf

1、馬鈴薯(Solanum mberosum L.)是繼小麥、玉米、水稻之后的世界第四大作物,在世界的食品安全體系中具有重要的作用.由青枯病菌Ralstonia solanacearum引起的馬鈴薯青枯病是僅次于馬鈴薯晚疫病的世界性病害,目前尚沒有行之有效的化學(xué)藥劑防治辦法,嚴(yán)重影響了馬鈴薯的生產(chǎn).培育抗病品種已成為防治馬鈴薯青枯病的根本手段.長(zhǎng)期以來人們對(duì)馬鈴薯青枯病的研究和探討主要集中在病菌的病理學(xué)機(jī)制、分類學(xué)、流行病學(xué)等方面,而在馬鈴

2、薯本身的抗病遺傳特性、馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的種類、數(shù)量及其表達(dá)調(diào)控途徑等方面還不清楚.本研究旨在通過馬鈴薯青枯病抗性相關(guān)基因的分離和分析,初步揭示參與青枯病抗性的基因種類與數(shù)量,為進(jìn)一步深入開展青枯病的抗病機(jī)制研究及利用抗性資源進(jìn)行抗病品種選育奠定基礎(chǔ).主要研究結(jié)果如下:1.建立了快速可靠的馬鈴薯抗青枯病鑒定新方法,并篩選出了13份抗或高抗青枯病和高感青枯病的二倍體材料.采用傳統(tǒng)方法和改進(jìn)方法對(duì)馬鈴薯二倍體CE和ED群體、番茄抗病和

3、感病品系進(jìn)行了青枯病抗性鑒定和評(píng)價(jià),建立了更加簡(jiǎn)便快速、經(jīng)濟(jì)和可重復(fù)的病菌鑒定新方法一莖枝菌液共培養(yǎng)法,該方法對(duì)于茄科作物的種質(zhì)資源抗病性評(píng)價(jià)和篩選,特別是對(duì)于病菌誘導(dǎo)產(chǎn)生抗性的抗(感)病植株的快速鑒定及其幼苗的先期快速篩選具有重要意義.同時(shí)利用該方法篩選出了6份抗或高抗青枯病材料和7份高感青枯病材料(見表2.4),其中6個(gè)材料(如高抗青枯病基因型ED13、高感青枯病基因型ED25等)已被用于親本構(gòu)建作圖群體,為今后開展馬鈴薯的抗病遺傳

4、研究奠定了基礎(chǔ).2.建立了富集差異表達(dá)基因的SSH文庫(kù)并獲得了44個(gè)病菌侵染早期馬鈴薯抗青枯病相關(guān)基因.以抗青枯病二倍體基因型ED13為材料,青枯病菌小種3號(hào)P041為供試菌株,利用抑制差減雜交(SSH)和微陣列雜交篩選技術(shù)相結(jié)合,獲得了123個(gè)差異表達(dá)的非重復(fù)的早期抗病相關(guān)基因EST片段,其中99個(gè)(80﹪)EST可找到與其具有較高同源性的序列(O),16個(gè)(13﹪)可找到較低同源性的序列(E-值>10<'-

5、10>.),8個(gè)(7﹪)無同源序列.這些無同源序列或具有較低同源性的序列可能代表新基因.在123個(gè)差異表達(dá)的EST中,除22﹪的功能未知或已知功能而未分類和8﹪的無同源序列外,其余70﹪的EST分屬于初級(jí)代謝、能量代謝、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、調(diào)控、蛋白合成/修飾/加工、轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)、抗病防御、轉(zhuǎn)錄相關(guān)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過程. 在獲得的123個(gè)差異表達(dá)EST中,至少有44個(gè)(約35.8﹪)參與了馬鈴薯的抗青枯病反應(yīng).這些EST對(duì)應(yīng)的基因涉及到信號(hào)識(shí)

6、別、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、過敏(HR)反應(yīng)、系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)、細(xì)胞自救與抗病防御等抗病反應(yīng)的基本過程.這些抗病相關(guān)基因中大部分與已知基因高度同源,預(yù)示著這些基因較為保守,在不同植物種的抗病反應(yīng)中可能具有重要的作用.3.構(gòu)建了一個(gè)富集青枯病抗性相關(guān)基因的SMART cDNA文庫(kù).以青枯病菌小種3號(hào)(P041)誘導(dǎo)24 h和148 h的馬鈴薯高抗青枯病二倍體基因型ED13的葉片為材料,利用SMART和LD-PCR技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建了一個(gè)富

7、集青枯病抗性相關(guān)基因的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù),為進(jìn)行重要基因全長(zhǎng)cDNA的克隆奠定了基礎(chǔ).所建文庫(kù)的原始文庫(kù)和擴(kuò)增文庫(kù)滴度分別為4.4×10<'6>和1.8×10<'10>pfu/ml,重組率為96﹪,插入片段大小分布在400-1800 bp,平均大小為700-1000 bp.4.獲得了三個(gè)基因的全長(zhǎng)cDNA、四個(gè)基因的RACE產(chǎn)物及它們的誘導(dǎo)表達(dá)模式.利用RAcE與LD-PCR方法和cDNA文庫(kù)相結(jié)合,快速獲得了三個(gè)具有完整開放閱讀框架基因

8、的全長(zhǎng)cDNA(StPI、StPMEI和StDnaJ)和四個(gè)抗病相關(guān)基因(L51、L77、L181和L362)cDNA的5'和3'RACE的PCR產(chǎn)物,同時(shí)研究了這些基因的誘導(dǎo)表達(dá).具體為: StPI編碼116個(gè)氨基酸,與馬鈴薯蛋白酶抑制子I前體cDNA有較高的同源性(核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為89﹪和74﹪).該基因受青枯病菌的誘導(dǎo)和JA的調(diào)節(jié),均為上調(diào).推測(cè)StPI基因是馬鈴薯蛋白酶抑制子基因家族的重要成員,在馬鈴薯的

9、抗青枯病的反應(yīng)中可能具有重要作用.該基因已在GenBank注冊(cè),序列號(hào)為DQ822994. StPMEI編碼198個(gè)氨基酸,與煙草果膠甲脂酶抑制子基因具有較高的同源性(核苷酸和氨基酸序列的同源性分別為85﹪和78﹪).StPMEI基因的表達(dá)受青枯病菌侵染的抑制,可能與病菌侵染早期促使果膠甲脂酶(PME)表現(xiàn)活性,加固細(xì)胞壁有關(guān);但該基因又受JA的誘導(dǎo)可能與病菌侵染后期細(xì)胞壁的擴(kuò)展和新細(xì)胞壁的建立有關(guān).該基因已在GenBank注冊(cè)

10、,序列號(hào)為DQ822993. StDnaJ編碼177個(gè)氨基酸,與擬南芥DnaJ-like基因的部分核苷酸具有84﹪的一致性,與其編碼的氨基酸序列具有59﹪的一致性.該基因受青枯病菌的誘導(dǎo),也受JA的調(diào)節(jié).但JA誘導(dǎo)后其上調(diào)表達(dá)明顯比青枯病菌誘導(dǎo)提前,且其維持高表達(dá)水平的時(shí)間也明顯縮短.該基因已在GenBank注冊(cè),序列號(hào)為DQ885360. L51(methyl-CpG-binding domain-containing

11、 protein)和L77(putatively encoding receptor-1ikekinase RHGl)均受青枯病菌的誘導(dǎo),但它們的受誘導(dǎo)速度不同.L51在6-12小時(shí)內(nèi)表達(dá)量即達(dá)到最高;L77約需48小時(shí)才可達(dá)到最高表達(dá)量.這兩個(gè)基因均不受JA的調(diào)節(jié). L181(phosphatase 2C)同時(shí)存在于抗病基因型和感病基因型中,在抗病基因型ED13中受青枯病菌的誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá),與此相反卻受JA的誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá);在感病

12、基因型ED25中,該基因不受JA調(diào)節(jié).預(yù)示著對(duì)于L181而言,病菌處理和JA刺激可能采用不同的調(diào)節(jié)途徑,并且該基因在抗病材料中因受誘導(dǎo)下調(diào)表達(dá)而參與抗病反應(yīng). L362(protein kinase Ptil)同時(shí)受青枯病菌的誘導(dǎo)和JA的調(diào)節(jié),其表達(dá)模式與StDnaJ相似,均為上調(diào)表達(dá).在處理24小時(shí)之前該基因的mRNA積累量即達(dá)到最高,并且L362在JA誘導(dǎo)后其上調(diào)表達(dá)明顯比青枯病菌的誘導(dǎo)提前.Ptil基因?yàn)镻ro基因的下游基