生物分子化學發(fā)光檢測新方法研究.pdf

1、核酸和蛋白質等生物分子的檢測是目前藥物分析、臨床診斷、環(huán)境監(jiān)測、微生物檢驗等領域的一個研究熱點，檢測方法包括有電化學法、分光光度法、熒光法、同位素法和化學發(fā)光法(CL)等。不同方法各有優(yōu)缺點，其中同位素法最為成熟，但存在一定的環(huán)境污染，對人的健康具有一定的損害。為替代同位素法，其它的非放射性技術，如有電化學法，酶法，熒光法，CL法等在近年來發(fā)展迅速。
　　CL分析法不需光源，儀器設備簡單、操作簡便，具有極高的靈敏度，已成為近年來一

2、個非常活躍的研究領域，目前已成功地應用在藥學、化學、分子生物學、臨床醫(yī)學和環(huán)境學等諸多領域。為此，本論文采用CL分析法，利用金納米粒子放大技術，模板識別技術和適配體技術，發(fā)展了多種具有創(chuàng)新意義的處理CL檢測方法，實現了對生物分子的簡單快速、高靈敏度和高選擇性檢測，整個論文由以下四部分構成:
　　第一章:緒論
　　緒論由兩節(jié)構成，其中第一節(jié)簡單介紹了多種信號放大技術在生物分子檢測領域的研究進展及其意義，主要內容包括:納米粒子放

3、大技術，酶放大技術，雜交鏈式反應放大技術和滾環(huán)擴增放大技術等，并列舉了近年來它們在該分析領域的部分典型示例;第二節(jié)闡述了本博士論文的研究目的、意義、主要內容及創(chuàng)新之處。
　　第二章:基于金納米粒子的生物分子化學發(fā)光檢測新技術
　　金納米粒子是一種理想的生物標記物，制備工藝簡單，性質穩(wěn)定，且固定在金納米粒子表面的生物分子仍能保持原有的生物活性，因此被廣泛地應用在生物分子檢測等研究領域。我們發(fā)現:金納米粒子和汞離子都能催化羥胺-

4、氯金酸反應，使金納米粒子粒徑增大或原位合成汞離子為核的金納米粒子，隨后催化魯米諾-硝酸銀(AgNO3)反應，產生CL信號?；谶@個原理，我們建立了兩種檢測方法:一種采用金納米粒子作為標記物，建立了夾心反應模式的特定序列DNACL檢測方法，隨后通過羥胺-氯金酸反應增大了金納米粒子的粒徑，得以放大CL信號，大幅提高了檢測靈敏度，如通過兩次放大，檢測限可達300 aM;另一種以核酸T堿基作為捕獲探針，捕獲汞離子后催化羥胺-氯金酸反應原位合成金

5、納米粒子，加入底物后產生CL信號，建立了汞離子的CL檢測方法。該方法簡單快速，對汞離子特異性高，靈敏度達10 ppt，達到美國EPA要求的最新汞離子檢出限。
　　第三章:基于模板識別的生物分子化學發(fā)光檢測新技術
　　本章建立了一種基于模板識別的DNA和蛋白質的CL檢測新技術。模板識別模式是將報告探針作為模板，在沒有目標分子的情況下，報告探針與捕獲探針之間的互補堿基不足以形成穩(wěn)定的雙鏈;只有當目標分子出現時，報告探針才能與捕獲

6、探針形成穩(wěn)定的雙鏈固定在載體上，產生CL信號。在第一節(jié)中，我們突破了傳統夾心法的限制，采用模板識別模式，建立了一種適合短鏈DNA的CL檢測方法。在該方法中，報告序列作為模板序列，只有在目標DNA存在的情況下，才能與具有8個堿基的捕獲探針互補雜交，生成穩(wěn)定的雜交復合物，產生CL信號。該方法簡單、快速，靈敏度可以達到10 amol，并且很容易拓展到多組分同時測定。在第二節(jié)中，我們將模板識別技術與適配體技術相結合，將適配體設計成報告探針，實現

7、了蛋白質的簡單、快速檢測。在本方法中，只有當目標蛋白PDGF存在時，報告探針中的適配體將識別PDGF并發(fā)生構象變化，提供足夠的堿基堆積力使報告探針與捕獲探針形成穩(wěn)定的雙鏈固定到96孔板上，之后結合標記物后產生CL信號，而在沒有目標蛋白PDGF存在的情況下，報告探針與捕獲探針不能穩(wěn)定結合。本節(jié)所構建的CL適配體檢測新技術，PDGF的檢測靈敏度可達10fM，且不需要使用抗體，應用范圍廣，能夠很容易拓寬至其它具有適配體的蛋白質如凝血酶甚至小分

8、子如腺苷、可卡因的檢測。
　　第四章:基于構象轉化的免標記miRNA化學發(fā)光適配體檢測技術
　　本章結合適配體技術和分子信標技術，提出了一種具有創(chuàng)新意義的變構分子信標技術。第一節(jié)以鏈霉親合素適配體-分子信標的構象轉化為基礎，構建了一種具有創(chuàng)新意義的基于磁性分離和適配體構象轉化的免標記miRNA CL檢測新技術，同時引入了雜交鏈式反應放大技術，大幅提高了檢測的靈敏度。第二節(jié)將酶循環(huán)放大的方法引入到miRNA的檢測當中，采用DN