hTERT在干細胞樣腫瘤細胞中的表達研究.pdf

1、目的：1.采用RQ-TRAP和 TRAP-ELISA法檢測不同細胞端粒酶活性，證實 RQ-TRAP法的優(yōu)越性,
　　2.研究比較干細胞樣腫瘤細胞與普通腫瘤細胞端粒長度的差異，探討干細胞樣腫瘤細胞中端粒的調節(jié)機制,
　　3.研究比較干細胞樣腫瘤細胞與普通腫瘤細胞端粒酶活性的差異和hTERT基因mRNA及蛋白質表達水平的差異。
　　方法：1.采用RQ-TRAP和TRAP-ELISA兩種方法同時檢測12（9個腫瘤細胞系和3個

2、正常細胞系）種細胞的端粒酶活性，并比較兩種方法的檢測結果,2.利用無血清懸浮培養(yǎng)的方法培養(yǎng)富集球狀生長的干細胞樣腫瘤細胞(sphere forming cells-SFCs)，采用流式細胞術檢測細胞表面標志物，比較干細胞樣腫瘤細胞比例的變化，用RT-PCR方法檢測、比較細胞的干性和分化標記物 Oct-4、SOX-2、CK-18的表達狀態(tài),3.采用實時熒光定量 PCR（Q-PCR）的方法檢測干細胞樣腫瘤細胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細胞的端粒長度4

3、.采用TRAP-ELISA方法檢測干細胞樣腫瘤細胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細胞的端粒酶活性5.以普通的RT-PCR方法檢測干細胞樣腫瘤細胞和正常培養(yǎng)的腫瘤細胞hTERT基因的mRNA的表達水平、以Western blot方法檢測其蛋白質表達水平。
　　結果：1. RQ-TRAP方法能準確特異地檢測系列稀釋的293T細胞蛋白提取液的端粒酶活性，靈敏度可達8個細胞，擴增效率為99％。陰性對照組則未檢測到端粒酶活性。RQ-TRAP方法測得12個

4、細胞系中端粒酶的活性與TRAP-ELISA方法結果有相關性（R2=0.7625）,
　　2.流式細胞術分析結果顯示無血清懸浮培養(yǎng)獲得較高比例的干細胞樣腫瘤細胞，并且比普通腫瘤細胞高表達干細胞轉錄因子Oct-4、SOX-2，低表達分化因子 CK-18（P＜0.05）,
　　3.通過 Q-PCR方法檢測結果分析，人乳腺癌干細胞樣腫瘤細胞（MCF7-SFCs）端粒長度（1.201±0.05212）長于人乳腺癌 MCF7細胞（1.0

5、19±0.1005），人宮頸癌干細胞樣腫瘤細胞（HeLa-SFCs）的端粒長度（1.602±0.1355）長于人宮頸癌 Hela細胞(1.024±0.0977)，經 t檢驗分析p＞0.05，乳腺癌干細胞樣腫瘤細胞和宮頸癌干細胞樣腫瘤細胞與腫瘤細胞間端粒長度的差異無統(tǒng)計學意義,
　　4.采用TRAP-ELISA法檢測端粒酶活性結果顯示：人乳腺癌 MCF7細胞系、人宮頸癌 Hela細胞系、人乳腺癌干細胞樣腫瘤細胞（MCF7-SFCs）

6、和人宮頸癌干細胞樣腫瘤細胞（HeLa-SFCs）端粒酶活性均陽性。干細胞樣腫瘤細胞的相對端粒酶活性（RTA）明顯低于普通腫瘤細胞，經 t檢驗分析p＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義。
　　5.干細胞樣腫瘤細胞（MCF7-SFCs和 Hela-SFCs細胞）hTERT mRNA表達低于普通腫瘤細胞（MCF7細胞和Hela細胞），經t檢驗分析P＜0.05，差異有統(tǒng)計學意義；干細胞樣腫瘤細胞的hTERT基因蛋白質表達水平均低于普通腫瘤細胞表達