血管內皮細胞生長抑制因子（VEGI）的結構與功能關系及作用機理研究.pdf

1、該課題對血管內皮細胞生長抑制因子(VEGI)的結構與功能關系及作用機制進行了研究.第一部分：EVGI結構與功能關系研究1.首先將VEGI與TNF超家族其他成員TNFα、TNFβ、CD40L及TRAIL進行了基于結構知識的一級結構序列聯(lián)配，比較分析了TNF超家族其他成員蛋白中結構與功能關鍵殘基的分布，在此基礎上分析推導出VEGI蛋白結構特異殘基的分布.2.根據(jù)TNF超家族其他成員TNFα、TNFβ、CD40L及TRAIL的晶體結構，采用同

2、源蛋白模建了VEGI蛋白質的三維結構.結果顯示：VEGI預測結構的骨架與TNFα晶體結構極為相似，也是由3個呈β-Jellyroll拓撲結構的亞基組成的鐘形結構.3.為研究蛋白質N端對活性的影響，構建了N端缺失43與51個氨基酸的VEGI表達載體并在大腸桿菌中表達及純化，采用人臍靜脈內皮細胞增殖和雞胚尿囊膜血管生成實驗研究了兩個缺失突變體的活性.結果表明：N端缺失43個氨基酸的VEGI突變體具有與野生型VEGI相似的作用，而N端缺失51

3、個氨基酸可使VEGI活性明顯降低.4.為研究VEGI空中樓間結構上的重要殘基的作用極其對生物活性的影響，采用定點突變技術突變了四個關鍵氨基酸E<'45>R,G<'47>A,Y<'111>F,Y<'111>T，構建了表達載體并在大腸肝菌中形式表達及純化，采用人臍靜脈內皮細胞增殖和雞胚尿囊膜血管生成實驗研究了四個突變體的活性.結果表明：E<'45>R突變體的活性顯著下降，G<'47>A突變體的活性略低于野生型VEGI，Y<'111>F,Y<

4、'111>T突變體的自學成才性比野生型VEGI下降十倍以上.第二部分：VEGI生物活性與作用機制研究1.以人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）為研究對象研究了VEGI對其增殖，遷移，白細胞粘附等體外生物活性的影響，結果表明：VEGI可劑量依賴地抑制HUVEC的增殖與遷移卻促進中性粒細胞附于HUVEC.2.采用RT-PCR，Western blot等方法研究了VEGI對VEGF與ICAM-1在內皮細胞中表達的影響.3.采用明膠酶譜方法研究了VE

5、GI對MMP-2表達的影響，結果表明：VEGI蛋白可顯著下調MMP-2激活形式的表達并呈劑量依賴的抑制作用.4.采用分光光度法研究了VEGI對NO產(chǎn)生的影響，結果表明：VEGI可劑量依賴地抑制HUVEC細胞產(chǎn)生NO.5.研究了VEGI對內皮細胞細胞周期的影響，結果顯示：VEGI可劑依賴地誘導HUVEC生長停滯于G<,0>-G<,I>期，抑制其進入S期.6.建立了裸鼠異種移植人肝癌SMMC7721的腫瘤模型，采用此模型研究了VEGI對人肝

6、癌的影響，結果顯示：VEGI顯著抑制人肝癌SMMC7721的生長，且其作用并非是直接抑制腫瘤細胞增殖而是部分通過抑制VEGF表達實現(xiàn)的.7.制作囝VEGI多克隆抗體.初步純化的抗體滴度達到期：10560，此抗體可中和重組VEGI蛋白抑制內皮細胞增殖與血管生成活性.進一步表明：VEGI是血管內皮細胞的特異性抑制因子.結論：我們的研究首次發(fā)現(xiàn)：VEGI三維結構是由3個呈β-Jellyroll拓撲結構的亞基組成的鐘形結構;VEGI的第44-5