應用基因芯片技術研究2型糖尿病胰島素抵抗脂肪組織相關基因表達及其鑒定.pdf

1、2型糖尿病的發(fā)病率近年來在全球逐年增長，在發(fā)達國家糖尿病患病率已達3-7％，成為僅次于癌腫、艾滋病、心血管病之后第4位需要優(yōu)先考慮的疾病，已成為世界第5位死亡主因，嚴重危害人民生活健康。2型糖尿病的發(fā)病機制目前尚不清楚，由于2型糖尿病的早期診斷至今并不理想，因此如何在分子水平探討2型糖尿病發(fā)病機制并對其進行早期診斷及預防已成為這一領域中的研究熱點。 胰島素抵抗為2型糖尿病的基本病理生理改變，同時也是一些代謝疾病如冠心病、高血壓、

2、肥胖及血脂異常、動脈粥樣硬化等發(fā)生的獨立危險因素。盡管脂肪組織在外周葡萄糖利用中只占有很小的比例，但它卻在胰島素抵抗過程中發(fā)揮重要作用。胰島素抵抗是遺傳因素和環(huán)境因素共同作用的結果。但即使將目前所知的環(huán)境因素均考慮在內(nèi)，也僅能解釋不到三分之一的胰島素抵抗成因。因此，遺傳因素可能是胰島素抵抗的主要原因。目前研究認為，2型糖尿病胰島素抵抗的發(fā)生是多種相關基因表達失常或失活所致。已發(fā)現(xiàn)胰島素抵抗的許多候選基因，如胰島素受體底物1，糖原合成酶，

3、UCP-3，GLUT4，己糖激酶Ⅱ，磷脂酰肌醇3-激酶，絲氨酸-蘇氨酸激酶，Rad基因與鈣調(diào)蛋白-10等。雖然已證實在2型糖尿病中確實存在這些物質(zhì)的改變，但還不清楚哪些基因是胰島素抵抗的主效基因、次效基因和微效基因。實驗表明在2型糖尿病胰島素抵抗產(chǎn)生的復雜過程中，很可能存在著這樣相互協(xié)調(diào)的共表達的基因群體。因而將在脂肪組織中各個環(huán)節(jié)和階段共同表達的眾多基因作為一個“基因群”(genecluster)進行研究，篩選在2型糖尿病胰島素抵抗過

4、程中的多個環(huán)節(jié)上起作用的分子和起關鍵性調(diào)控作用的基因，發(fā)現(xiàn)脂肪組織與胰島素抵抗的內(nèi)在聯(lián)系，揭示胰島素抵抗的本質(zhì)，將對于早期診斷2型糖尿病、有效地預防2型糖尿病及指導進一步治療具有重要意義。 基因芯片也稱為基因微矩陣(Microarray)，是近幾年發(fā)展起來的一項前沿生物技術。它在一次實驗中可以對上萬種基因的表達水平進行快速、準確、高效的檢測，從而達到高效率、高通量、低成本地篩查和分析差異表達基因的目的，為研究在2型糖尿病胰島素抵

5、抗過程中各個環(huán)節(jié)和階段相互協(xié)調(diào)、共同表達的基因群提供了強有力的工具。 [研究目的] 應用基因芯片技術比較2型糖尿病胰島素抵抗患者與正常人大網(wǎng)膜脂肪組織相關基因表達譜的差異，以進一步闡明胰島素抵抗的發(fā)病機制并探索新的治療方法。 [實驗方法] 1、依照穩(wěn)態(tài)模式評估法的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)作為胰島素抵抗(IR)的診斷標準，收集伴IR的2型糖尿病(實驗組)及無IR血糖正常(對照組)配對大網(wǎng)膜標本各2例

6、，均取自外科手術患者。 2、一步法抽提大網(wǎng)膜脂肪組織總RNA，純化mRNA，將4096種人類基因PCR產(chǎn)物用Cartesian點樣微矩陣列點樣于化學涂層的載玻片上，制成基因芯片，并重復兩次；分別以Cy5和Cy3兩種熒光染料通過逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)將胰島素抵抗組和對照組脂肪組織的mRNA標記成探針，并與基因表達譜芯片進行雜交。通過GenePix4000B掃描儀掃描芯片熒光信號圖像，經(jīng)計算機軟件分析，尋找兩組差異表達基

7、因。 3、抽提大網(wǎng)膜脂肪組織總RNA，設計并合成雙特異性有絲分裂原激活的蛋白激酶磷酸酶4(MKP-4)、磷脂酰肌醇4-磷酸鹽5-激酶Ⅱ型β(PIP5K2B)、叉頭框C2(FOXC2)引物，分別進行RT-PCR和Northernblot半定量分析其mRNA表達量，對基因芯片的結果進行驗證。 [結果] 1、按差異顯著陽性標準，通過2次基因芯片篩選，從4096個基因中篩選出在大網(wǎng)膜脂肪組織中與2型糖尿病胰島素抵抗可能相

8、關的共同差異表達的82條基因，其中42條基因表達上調(diào)(2.0倍以上)，40條基因表達下調(diào)(0.5倍以下)。差異表達基因涉及代謝，細胞信號轉導，還包括原癌與抑癌基因、離子通道與運輸?shù)鞍谆?、凋亡基因、免疫相關基因、蛋白翻譯合成基因、細胞增殖與分化相關基因、細胞骨架組成基因等。 2、與2型糖尿病胰島素抵抗明顯相關的差異表達基因主要集中在信號轉導通路及代謝方面。其中，與細胞信號轉導相關的MKP-4及與脂肪細胞代謝相關的叉頭框C2(FO

9、XC2)表達明顯增加，而PIP5K2B明顯減少。 3、RT-PCR顯示MKP-4在2型糖尿病胰島素抵抗患者的大網(wǎng)膜脂肪組織中高表達，PIP5K2B是低表達。Northernblot半定量研究顯示編碼FOXC2的基因在2型糖尿病胰島素抵抗大網(wǎng)膜脂肪組織中高表達。結果與基因表達譜芯片結果吻合。 [結論] 1、胰島素抵抗是2型糖尿病的基本病理生理改變。應用基因芯片技術比較2型糖尿病伴胰島素抵抗患者與無胰島素抵抗正常對照

10、的大網(wǎng)膜脂肪組織mRNA差異表達基因，實驗結果證實脂肪組織與胰島素抵抗機制密切相關，差異表達基因主要集中在信號轉導通路及代謝方面。說明2型糖尿病胰島素抵抗是多基因因素共同改變的結果，同時與胰島素信號轉導通路及代謝密切相關，應用用基因芯片技術對2型糖尿病胰島素抵抗過程中的眾多基因表達方式進行深入研究是可行的。 2、分別應用RT-PCR對MKP-4、PIP5K2B進行驗證，應用Northernblot對FOXC2驗證，結果與芯片掃描