氧化應(yīng)激下肺泡Ⅱ型上皮細胞凋亡和JNK的調(diào)控機制.pdf

1、第一部分 原代大鼠肺泡II型上皮細胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定背景肺泡上皮易受各種應(yīng)激的損傷，它的損傷后修復(fù)主要依賴于肺泡上皮的干細胞——肺泡II型上皮細胞(alveolar type II epithelial cells，ATII cells)。ATII細胞體積較小、呈立方形，占肺泡上皮細胞數(shù)的60％左右，能通過增殖、鋪展、遷移，并最終轉(zhuǎn)化為肺泡I型上皮細胞(alveolartype I epithelial cells，ATI

2、 cells)，恢復(fù)肺泡上皮正常的形態(tài)和功能。另外，ATII細胞還具有很多重要功能：合成、分泌和重新利用表面活性物質(zhì)；轉(zhuǎn)運離子和水分；合成免疫效應(yīng)分子。但ATII細胞的原代分離、純化技術(shù)較為復(fù)雜，本研究的目的是掌握成年大鼠ATII細胞的分離、純化和培養(yǎng)技術(shù)，以獲得數(shù)量足夠、純度高的ATII細胞，滿足下一步實驗的需要。 目的： 確定成年大鼠原代ATII細胞分離、純化、培養(yǎng)的技術(shù)方法，為研究氧化應(yīng)激下ATII細胞存活、凋亡和

3、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制提供數(shù)量足夠和高純度的ATII細胞，以滿足實驗的需要。 方法： 水合氯醛麻醉清潔級Spraque-Dawley大鼠(約200g)，打開胸腔行肺動脈插管，以生理鹽水沖凈肺血。整體取出心肺和氣管，氣管插管，以緩沖液灌洗肺泡腔10次。將0.08％胰蛋白酶消化液從氣管注入肺泡，置于37℃，5％二氧化碳(carbon dioxide，CO2)培養(yǎng)箱，每隔5分鐘添加適量消化液，20分鐘后，去除氣管及肺門周圍結(jié)締組織置于2

4、.50μg/ml脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I，Dnase I)和終止血清混合液中，快速剪肺至1mm3小塊，篩網(wǎng)過濾，離心收集細胞，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞并轉(zhuǎn)移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中，吸附純化2h，用含10％胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，接種于6孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板，細胞接種后24h換液，繼續(xù)培養(yǎng)12h備用。臺盼藍拒染法測定細胞活力。透射電鏡

5、(Transmitting electron microscopy,FEM)鑒定細胞，改良巴式染色法確定細胞純度。在體外培養(yǎng)細胞不同的時間(36、72、96和120h)觀察細胞的性狀和形態(tài)變化。 結(jié)論： 利用0.08％胰酶消化分離和大鼠Ig免疫粘附純化，可獲得高產(chǎn)量、高純度、高活力的原代AT Ⅱ細胞，能滿足實驗的需要。AtⅡ細胞體外培養(yǎng)36至72h時生長良好，可進行體外實驗。 第二部分 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡Ⅱ

6、型上皮細胞的損傷作用及JNK調(diào)控作用背景氧氣療法是臨床上治療急性呼吸衰竭常用且有效的措施，但長時間高氧暴露可引起氧化應(yīng)激性肺損傷。高濃度氧氣(氧氣體積分數(shù)＞0.95，簡稱高氧)暴露下產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素。ROS可造成細胞膜脂質(zhì)的過氧化損傷，蛋白質(zhì)的應(yīng)激性修飾，基因的畸變等細胞損傷，導(dǎo)致細胞完整性和功能的破壞。更為重要的是ROS還可通過激活細胞內(nèi)凋亡信號

7、系統(tǒng)而參與細胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族信號通路是多種刺激通過細胞膜到達細胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38三條信號通路組成，其中JNK信號通路是

8、一條主要的應(yīng)激信號通路，在調(diào)控細胞的生長、凋亡和免疫反應(yīng)等方面具有重要作用，但JNK信號的作用因細胞種類、刺激類型而有所差異。氧化應(yīng)激下AtⅡ細胞的凋亡(在肺損傷和纖維化中具有重要作用)可能涉及JNK信號，但JNK信號在其中起的作用尚不清除。 目的： 1.采用過氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)和無血清培養(yǎng)基建立原代大鼠AtⅡ細胞的氧化損傷模型。 2.研究H2O2對AtⅡ細胞形態(tài)、存活和凋亡的

9、影響，探討細胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應(yīng)關(guān)系。 3.了解氧化應(yīng)激下AtⅡ細胞凋亡過程中JNK的活化情況，并采用JNK信號抑制劑預(yù)先干預(yù)，觀察其是否能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的JNK的活化，從而研究JNK對細胞凋亡的作用。 方法： 分離、純化清潔級Spraque-Dawley成年大鼠的AtⅡ細胞，臺盼蘭拒染法鑒定細胞活性，改良巴氏染色法鑒定細胞純度。AtⅡ細胞用不同濃度的H2O2(0μM、50μM、100μM、

10、500μM和1000μM)處理3h；以500μMH2O2處理不同時間(0h、1h、3h、6h和9h)；采用倒置相差顯微鏡細胞形態(tài)變化，MTT比色法測定細胞存活率，流式細胞術(shù)定量檢測凋亡率，以明確細胞損傷與H2O2作用的濃度和時間效應(yīng)關(guān)系。500μM H2O2作用細胞3h后，透射電鏡觀察細胞凋亡改變。Western blot檢測500μM H2O2刺激ATII細胞(0、5、10、30、60、180、360和540min)后p-JNK的表達

11、。在研究JNK信號作用時，細胞隨機分為4組：以無血清培養(yǎng)基作用細胞3h，設(shè)為對照組(CON組)；25μMSP600125(JNK信號特異性抑制劑)預(yù)處理，再以無血清培養(yǎng)基作用細胞3h，設(shè)為CON+SP組；以500μM H2O2作用細胞3h，設(shè)為H2O2組；細胞預(yù)先加入25μM SP600125(JNK信號特異性抑制劑)，再以500μM H2O2刺激3h，設(shè)為H2O2+SP組，檢測細胞的存活率和凋亡率；熒光顯微鏡觀察熒光染料4，6一二咪基

12、一--聯(lián)苯基吲哚(4'，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色后細胞核的形態(tài)變化。 結(jié)論： 1.H2O2以濃度和時間依賴的方式誘導(dǎo)AT Ⅱ細胞損傷。 2.通過流式細胞儀和電鏡證實：H2O2刺激可誘導(dǎo)AT Ⅱ細胞發(fā)生凋亡。 3.JNK參與了氧化應(yīng)激下ATII細胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，并對AT Ⅱ細胞起促凋亡的作用。 第三部分 JNK對AT Ⅱ細胞凋亡相關(guān)蛋白及核轉(zhuǎn)錄因

13、子表達或活化的調(diào)控作用背景目前廣泛認為在高氧暴露過程中產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素，ROS刺激可引起肺組織細胞的凋亡。近年來，ROS對細胞凋亡的調(diào)控作用逐漸引起人們的重視。ATII細胞對維持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用，如果它過度凋亡，肺損傷和組織纖維化將不可避免。越來越多的研究者關(guān)注ATII細胞的凋亡，但是氧化應(yīng)激下ATII細胞凋亡的機制尚不明確。第二部分證實了JNK信號通路參與了氧化應(yīng)激下ATII細

14、胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并對ATII細胞起促凋亡的作用，但JNK究竟通過哪些途徑達到促細胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分進一步研究ROS對肺泡上皮細胞凋亡相關(guān)蛋白表達和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響，并探索JNK信號對凋亡相關(guān)蛋白表達和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 目的： 1.觀察ROS對ATII細胞線粒體膜電位(Mitochondrial transmembranepotential，MMP)的損傷作用。 2.研究ROS對肺泡上皮細胞凋

15、亡相關(guān)蛋白表達和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 3.使用JNK信號抑制劑SP600125，探索JNK信號對氧化應(yīng)激下ATII細胞凋亡相關(guān)蛋白表達和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 結(jié)論： 1.H2O2刺激能破壞AtⅡ細胞線粒體膜電位，隨刺激時間的延長，線粒體膜電位明顯下降。 2.H2O2刺激能通過JNK信號通路，明顯上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的表達與活化，

16、從而起到促細胞凋亡作用。 第四部分 NAC對氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細胞的調(diào)控作用背景既然氧化應(yīng)激下ROS對細胞的死亡起著關(guān)鍵作用，我們認為抗氧化處理可能有助于抑制氧化應(yīng)激下AtⅡ細胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)可作為還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione，GSH)合成的前體，在氧化應(yīng)激下多種細胞的研究中已顯示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC處理能否

17、對氧化應(yīng)激下AtⅡ細胞起到保護作用。本研究探討NAC對氧化應(yīng)激下MAPKs激活的影響和AtⅡ細胞的保護作用。 目的： 1.研究NAC預(yù)處理能否對氧化應(yīng)激下的AtⅡ細胞起保護作用。 2.研究NAC預(yù)處理對H2O2刺激后AtⅡ細胞內(nèi)ROS水平及MAPKs激活的影響。方法原代培養(yǎng)的大鼠ATII細胞，隨機分為4組：正常對照組(CON組)、CON+NAC組、H2O2組和H2O2+NAC組。MTT法檢測各組細胞存活率的變化，