南瓜蛋白的原核表達及生物學活性測定.pdf

1、目的：從南瓜果肉中提取南瓜蛋白過程繁瑣，周期較長，且提取的南瓜蛋白在動物體內免疫原性較強。為解決上述一系列問題，基于南瓜蛋白的基因組成已知，可用原核表達系統(tǒng)制備，其操作簡單，周期較短，耗材少。此種制備南瓜蛋白方法的建立不僅可以為制備活性更高但體內免疫原性更低的南瓜蛋白突變體奠定了基礎，也可以對南瓜蛋白基因定點突變或增加半胱氨酸為抗體交聯提供一種新的方法。
　　方法：將含重組南瓜蛋白基因的質粒轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，篩選陽

2、性菌進行擴大培養(yǎng)后，用IPTG低溫誘導目的基因表達，通過SDS-PAGE鑒定其表達形式；用鎳柱親和層析法分離純化可溶性重組蛋白，用離子交換柱進一步純化目的蛋白；用SRB法和MTT法檢測其對部分體外腫瘤細胞的增殖抑制作用；將rCUS免疫BALB/C小鼠去眼球取血通過間接ELISA測其對小鼠的免疫原性。
　　結果：重組蛋白大部分以包涵體形式表達，少部分以可溶性形式表達，嘗試多種復性方法對包涵體復性，但復性效率太低或者復性后穩(wěn)定性差或者

3、體外藥理活性不高，故通過鎳柱親和層析法獲得可溶性表達產物，用離子交換柱純化后可得到純度在95％的重組蛋白，其對體外胰腺癌細胞PANC-1、胃癌細胞SGC-7901、淋巴癌細胞 Raji、白血病細胞 HL-60的IC50值分別為（6.0564±0.0014）μg/ml、（4.7697±0.0014）μg/ml、（9.9811±0.0018）μg/ml、（4.9640±0.0018）μg/ml。間接ELISA法測其對BALB/C小鼠的抗體滴