花生PEPC家族基因分析及反義PEPC1基因遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、植物油是人類(lèi)日常生活所需要的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是重要的工業(yè)原料。由于人口增長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)發(fā)展、農(nóng)產(chǎn)品消費(fèi)結(jié)構(gòu)變化等因素的影響，使得國(guó)內(nèi)外植物油脂市場(chǎng)需求量驟增。目前我國(guó)植物油供需矛盾突出，自給率不足35％。提高油料作物的含油量是增加油脂產(chǎn)量的有效途徑?；ㄉ俏覈?guó)最重要的油料作物之一，與大豆、油菜等主要油料作物相比，花生單位面積產(chǎn)油量最高。花生種子含油量45-56%，具有進(jìn)一步提高的潛力。
　　近年來(lái)，隨著花生基因組測(cè)序工作的開(kāi)展、花生轉(zhuǎn)基

2、因技術(shù)的逐步完善，使得通過(guò)轉(zhuǎn)基因、分子育種手段培育高油花生品種成為可能。油脂合成和蛋白質(zhì)合成存在一定的競(jìng)爭(zhēng)性，兩個(gè)代謝過(guò)程均需要利用磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate, PEP）做底物。乙酰輔酶A羧化酶（ACCase）催化丙酮酸合成乙酰-CoA，進(jìn)入脂肪酸合成途徑，而磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC）可催化丙酮酸合成草酰乙酸，進(jìn)入蛋白質(zhì)合成途徑。PE

3、PC在植物中具有多種生理功能，研究表明PEPC參與碳/氮吸收、脂肪酸調(diào)控并與鹽和干旱脅迫反應(yīng)有關(guān)，但對(duì)其功能認(rèn)識(shí)仍然非常有限。目前，花生中PEPC基因功能深入研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析了花生PEPC家族基因的表達(dá)特性；在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建AhPEPC1基因的反向表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化花生，通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植株性狀分析，研究該基因在提高花生油脂含量中的作用及其分子機(jī)制。研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步提高花生含油量具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
　　本研究取得以下結(jié)果：

4、r>　　1、通過(guò)氨基酸序列比對(duì)、保守結(jié)構(gòu)域分析、基因結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)以及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析等生物信息學(xué)分析方法，將花生PEPC家族5個(gè)基因分為兩類(lèi)：AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3和 AhPEPC4基因編碼植物型 PEPC，AhPEPC5基因編碼細(xì)菌型 PEPC。AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3和AhPEPC4基因結(jié)構(gòu)由10個(gè)外顯子和9個(gè)內(nèi)含子組成；AhPEPC5基因結(jié)構(gòu)由20個(gè)外顯子和19個(gè)內(nèi)含子組成。
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5、、通過(guò)花生不同組織和不同發(fā)育時(shí)期的熒光定量 PCR分析，發(fā)現(xiàn) AhPEPC1、AhPEPC2、AhPEPC3、AhPEPC4和AhPEPC5基因在根、莖、葉和種子中均有表達(dá)但表達(dá)模式不同。AhPEPC1基因在種子中的表達(dá)量最高，AhPEPC3基因在根中的表達(dá)量較高，AhPEPC4基因在葉中的表達(dá)量較高。
　　3、將AhPEPC1基因片段反向連接植物雙元表達(dá)載體pCAMBIA1301，構(gòu)建獲得反義表達(dá)載體 pCAMBIA1301-P

6、EPC，農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化花生。經(jīng)潮霉素篩選后，利用特異引物 PCR檢測(cè)獲得陽(yáng)性植株。表型觀察發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因花生農(nóng)藝性狀未發(fā)生明顯改變，與對(duì)照花生相比，轉(zhuǎn)基因花生種子含油量提高了5.7%-10.3%，脂肪酸組分相對(duì)含量沒(méi)有變化，但種子蛋白質(zhì)含量降低了7.5%-17.0%，轉(zhuǎn)基因花生萌發(fā)過(guò)程中對(duì)鹽脅迫耐受性增強(qiáng)。
　　4、為了進(jìn)一步分析轉(zhuǎn)基因花生中AhPEPC1基因的抑制表達(dá)是否影響其他基因的功能，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析。結(jié)果表