腺病毒介導(dǎo)的p21基因轉(zhuǎn)染治療大鼠左向右分流型肺動(dòng)脈高壓的研究.pdf

1、目的：研究復(fù)制缺陷性腺病毒攜帶抗增殖性基因p21基因轉(zhuǎn)染左向右分流型先心病肺動(dòng)脈高壓大鼠模型的可行性，觀察轉(zhuǎn)染后目的基因的表達(dá)情況，及其對(duì)肺動(dòng)脈高壓的抑制作用和對(duì)肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。 方法：以含全長(zhǎng)人p21基因的cDNA的質(zhì)粒(pCEP-wafl)為模板，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增全長(zhǎng)p21基因編碼區(qū)cDNA，將其與穿梭質(zhì)粒采用相同的限制性?xún)?nèi)切酶(XbaI 和KPNI)分別酶切，連接將p21裝入穿梭質(zhì)粒，再將穿梭質(zhì)

2、粒、E1及E3區(qū)缺失的5型腺病毒經(jīng)相同限制性?xún)?nèi)切酶(PI-FceI和I-CeuI)分別酶切，連接獲得攜帶目的基因的重組腺病毒(Adeno-p21)，該病毒經(jīng)PacI酶切線性化后采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Clonfectin)試劑轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞HEK293進(jìn)行包裝、擴(kuò)增，獲得高滴度的重組腺病毒；PCR法鑒定Adeno-p21，End-Point稀釋法測(cè)定其滴度。同法創(chuàng)建對(duì)照組病毒hdeno-lacZ。48只大鼠隨機(jī)分為4組：Ⅰ組(n=10)為空白對(duì)

3、照組，僅做假手術(shù)處理；Ⅱ組(n=13)為模型對(duì)照組，通過(guò)套管法建立左向右分流型PH模型；Ⅲ組(n=14)為實(shí)驗(yàn)組，建立PH模型，并通過(guò)氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-p21重組腺病毒；Ⅳ組(n=11)為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組，建立PH模型，并通過(guò)氣管吸入法轉(zhuǎn)染Adeno-lacZ重組腺病毒。16周后右心導(dǎo)管法測(cè)量各組大鼠右室平均壓(mRVP)和肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(RVHI)及RV/BW，評(píng)估p21對(duì)血流動(dòng)力學(xué)的影響，HE染色觀察

4、小動(dòng)脈結(jié)構(gòu)、測(cè)量小動(dòng)脈管徑及管壁厚度計(jì)算WT﹪，Ⅲ、Ⅳ組Western blot法鑒定p21基因產(chǎn)物在肺組織中的表達(dá)。采用免疫組織化學(xué)方法研究肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞PCNA的表達(dá)，并通過(guò)原位缺口末端標(biāo)記方法(TUNEL)檢測(cè)大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡，分別計(jì)算增殖指數(shù)(PI)、凋亡指數(shù)(AI)及PI/AI。 結(jié)果：1．PCR法從構(gòu)建重組的腺病毒中擴(kuò)增出腺病毒(370bp)及p21(489bp)的特異性片斷，表明獲得所需的攜帶目的基因的

5、重組腺病毒，稀釋法測(cè)得Adeno-p21和Adeno-lacZ的感染滴度分別是2×10<'8>pfu/L和1.2×10<'8>pfu/L。 2．Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的mRVP、mPAP及WT﹪均明顯高于Ⅰ組(P<0.05)，Ⅱ、Ⅳ組RVHI明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅱ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP、RVH工及WT﹪明顯降低(P<0.05)，但與Ⅰ組相比，Ⅲ組的mPAP、mPVP及WT﹪仍明顯高于Ⅰ組(P<0.05)；與Ⅳ組相比，

6、Ⅲ組的各項(xiàng)指標(biāo)均低于Ⅳ組(P<0.05)。HE染色標(biāo)本上可見(jiàn)，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組肺動(dòng)脈肌層及內(nèi)膜均有不同程度的增厚以及肺小動(dòng)脈肌化管腔狹窄；而Ⅰ組血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)，管壁薄，厚度均勻一致。 3．Western blot結(jié)果示Ⅲ組出現(xiàn)21kd的特異性條帶，提示目的基因已成功表達(dá)功能蛋白。 4．轉(zhuǎn)染p21基因的Ⅲ組，PI明顯低于Ⅱ組與Ⅳ組(P<0.05)，AI明顯增高，高于其他三組(P<0.05)，PI/AI明顯低于Ⅱ組與