心臟重構過程心室應變與生存蛋白的相關性研究.pdf

1、研究背景和目的：心肌梗塞是臨床上常見的疾病，心肌梗塞后心臟重構與致殘和致死密切相關。心肌梗塞后發(fā)生一系列分子生物學改變參與心臟重構過程。許多生長因子和細胞因子均可誘導絲氨酸/蘇氨酸激酶Pim-1，Pim-1進而在細胞信號傳導中發(fā)揮重要作用。最近研究發(fā)現(xiàn)Pim-1在心肌細胞中是Akt下游重要的生存調節(jié)子。許多研究關注于Akt在心肌細胞中的保護作用，但Pim-1作為信號蛋白的心臟保護作用還有待闡明。為了探討心肌梗塞后心臟重構的細胞分子生物學

2、改變及其相關機制并重點對Pim-1在其中的作用進行探討，本實驗通過綿羊心肌梗塞后心臟重構的動物模型，克隆并測序綿羊Pim-1信使RNA，探討Pim-1相關生存蛋白在重構心肌中與重構張力和心肌細胞凋亡的關系。 方法：2007年受國家留學基金公派到美國馬里蘭大學，實行聯(lián)合培養(yǎng)計劃，對冠狀動脈缺血性心臟病進行相關課題的研究，選擇心肌梗塞后心臟重構的相關研究。采用Dorset雄性雜交綿羊13只，隨機分為兩組：未手術組（n=5）和手術組（

3、n=8）。手術組采用直接縫扎冠狀動脈造成心尖部25％心肌梗塞。采集血流動力學和超聲心動圖，使用超聲微測量技術實時監(jiān)測左室游離壁的運動和形變，計算收縮末期和舒張末期張力，并收集未手術組和手術組心肌梗塞后10周的左室游離壁心肌組織行HE染色，評價動物模型和心臟重構的區(qū)域性。采取手術組左室游離壁心肌組織，提取總RNA，行逆轉錄聚合酶鏈式反應合成cDNA，使用特異性引物擴增PIM-1信使RNA，以Sanger末端終止法測序，使用軟件進行拼接和分

4、析。采取未手術組和手術組心肌梗塞后10周的左室游離壁遠離梗塞區(qū)和臨近梗塞區(qū)心肌組織行實時定量PCR、WesternBlot檢測Pim-1相關生存蛋白在重構心肌中的轉錄和翻譯水平，免疫共沉淀檢測不同區(qū)域Pim-1與其降解途徑中重要分子伴侶Hsp70、Hsp90的關系，免疫熒光染色顯示Pim-1的分布，TUNEL檢測細胞凋亡。 結果：心肌梗塞后手術組實驗動物左室收縮末期容積和左室舒張末期容積顯著增加，射血分數(shù)顯著降低，室壁運動異常長

5、度及室壁運動異常長度與同切面心內膜周長的比值均顯著增加，心率、血壓、心輸出量無顯著性差異。收縮末期和舒張末期張力呈區(qū)域性分布，在心肌梗塞區(qū)、臨近梗塞區(qū)與遠離梗塞區(qū)之間有顯著差異，收縮末期張力顯著下降，舒張末期張力顯著增加?？寺〔y序綿羊PIM-1信使RNA1341bp，分析發(fā)現(xiàn)其使用兩個不同的起始密碼子編碼分子量為33kD和44kD的Pim-1蛋白，與人類及其他哺乳動物有高度同源性，5’端非編碼區(qū)對于PIM-1信使RNA翻譯起重要作用。

6、與未手術組相比，手術組臨近梗塞區(qū)PIM-1mRNA、全細胞和細胞質44kD、33kDPim-1蛋白顯著增加，遠離梗塞區(qū)無明顯增加；Pim-1上游調控蛋白Akt在手術組臨近梗塞區(qū)顯著增加，在遠離梗塞區(qū)無明顯增加；臨近梗塞區(qū)與Pim-1結合的Hsp90和Hsp70的比值顯著增加，遠離梗塞區(qū)無明顯變化；Pim-1下游關鍵的抗凋亡蛋白：Bcl-2mRNA和蛋白在手術組臨近梗區(qū)明顯增加，Bcl-xLmRNA無明顯變化，Bcl-xL蛋白臨近梗塞區(qū)增

7、加，磷酸化Bad（Ser112）蛋白在臨近梗塞區(qū)明顯增加，遠離梗塞區(qū)均無明顯變化；TUNEL陽性細胞數(shù)在臨近梗塞區(qū)顯著增加，遠離梗塞區(qū)無明顯增加。重構張力和對應的生存蛋白水平相關分析顯示生存蛋白水平與重構張力呈顯著正相關。 結論：冠狀動脈結扎術建立綿羊心肌梗塞后心臟重構動物模型，可作為單發(fā)中等大小的心肌梗塞后心臟重構代表性的動物模型。通過心室表面超聲微探頭陣列實時監(jiān)測心臟重構發(fā)現(xiàn)心肌梗塞后心臟重構是不均一的，收縮末期張力和舒張末

8、期（重構）張力存在區(qū)域性的差別。綿羊PIM-1信使RNA全編碼區(qū)和部分非編碼區(qū)以及翻譯產物與人及其他哺乳動物有高度同源性，在進化上高度保守。它可使用兩個不同的起始密碼子編碼分子量為33kD和44kD的Pim-1蛋白，5’端非編碼區(qū)對于其翻譯起重要作用。綿羊心臟重構模型中Pim-1水平受多種調節(jié)機制控制，Pim-1相關生存蛋白呈區(qū)域性分布，并與重構張力相關，但這種上調不足以保護心肌細胞免于凋亡。 創(chuàng)新和展望 1.首次成功建