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文檔簡介
1、目的: 促腦卒中后的血管新生治療是近年來抗腦缺血藥物研究的熱點之一。羥基紅花黃色素A(hydroxysaffior yellow A,HSYA)是傳統(tǒng)活血化瘀中藥紅花的主要活性成分之一。我們前期研究結果提示HSYA可能通過促進血管新生而發(fā)揮腦保護作用,本研究旨在對其促腦缺血后血管新生的早期分子基礎做初步探討。 方法: 1. 建立線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞(Middle cerebral artery occlus
2、ion,MCAO)模型,設缺血后6h、12h、24h三個時間點,每個時間點分為假手術組(n=8)、模型組(n=8)、陽性對照藥組(MK801 0.5mg/kg,n=8)和HSYA治療組(60mg/kg,n=8)。缺血后即刻舌下靜脈給藥,HSYA組以一個半衰期(30min)為間隔連續(xù)給藥5次(每次12mg/kg),總給藥劑量60mg/kg。于腦缺血后6h、12h和24h三個時間點分別觀察HSYA對腦缺血大鼠神經(jīng)行為障礙和MCAO大鼠腦梗死
3、體積的影響。 2.以MCAO大鼠為模型,設缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h五個時間點,每個時間點分為假手術組、模型組和HSYA治療組(n=3),給藥方法同上。選用包括與血管新生密切相關的生長因子、生長因子受體、黏附分子、轉錄因子等113個基因的血管生成功能分類基因芯片,檢測HSYA在各個時間點對大鼠缺血側皮層半暗帶中血管新生相關基因轉錄水平的影響。使用綜合型GEArray表達分析配套軟件進行完整的芯片數(shù)據(jù)分析。
4、 3.在分析基因芯片結果的基礎上,應用RT-PCR法觀察HSYA對線栓法致急性腦缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血側皮層半暗帶中HIF-1α、VEGF、Flt、bFGF、aFGF五個血管新生密切相關基因的mRNA表達的影響,以GAPDH為內參,結果采用圖像分析軟件進行半定量分析。同時采用實時定量PCR法分析HSYA對大鼠急性腦缺血后3h、24h缺血側皮層半暗帶中HIF-1α、VEGFmRNA表達的影響。以GAPDH為內參,獲
5、得HIF-1α、VEGF mRNA的相對含量做組間比較。 4.采用Western Blotting法分別觀察HSYA對線栓法致急性腦缺血后1.5h、3h、6h、12h、24h缺血側皮層半暗帶中HIF-1α、VEGF、Fit、bFGF、aFGF蛋白表達的影響,以GAPDH為內參,結果采用圖像分析軟件進行半定量分析。 結果: 1. 與假手術組相比,缺血后6h、12h和24h,模型組大鼠神經(jīng)行為障礙明顯,腦梗死體積顯著
6、增加,陽性對照藥MK801靜脈給藥明顯改善腦缺血動物神經(jīng)癥狀,減小腦梗死體積(P<0.05);HSYA給藥組各個時間點動物神經(jīng)行為癥狀均得到明顯改善,腦梗死體積顯著減小(P<0.05)。 2.基因芯片結果提示,與假手術組比較,缺血24小時內:MCAO模型組有75個基因表達發(fā)生顯著變化,其中19個顯著上調,56個顯著下調;大部分血管新生激活基因(如缺氧誘導因子、酸性成纖維生長因子、表皮生長因子、胰島素樣生長因子等)在缺血后有不同程
7、度的表達下調;IL-1β、MCP-1等炎癥和趨化因子基因持續(xù)上調;抗炎細胞因子IL-10在缺血后3h和24h顯著下調。而HSYA給藥組,有85個發(fā)生顯著變化,其中58個顯著上調,27個顯著下調。上調最為明顯的是血管新生誘導因子基因(如HIF.1α、VEGF、aFGF、Ang2等)和炎癥相關因子基因(如IL-6、IL1β、IL-10等);下調的有凝血酶敏感素等基因。 3. RT-PCR和實時定量PCR結果綜合顯示,與假手術組比較,
8、缺血后3小時模型組腦皮層半暗帶的VEGF、HIF-1α、Flt、bFGF基因表達有顯著下調(P<0.05),而HSYA可使aFGF、bFGF、Flt、HIF-1αmRNA表達明顯上調(P<0.05);缺血后24h,在模型組中HIF-1α、Flt mRNA表達上調的基礎上,HSYA可使bFGF、VFGF mRNA表達顯著增加(P<0.05)。 4.蛋白免疫印跡研究顯示,MCAO后24h內,HSYA可先后使缺血側腦皮層半暗帶HIF-
9、lα、Flt、aFGF、bFGF蛋白的表達顯著上調,與模型組比較有顯著差異(P<0.05),其上調作用具有不同的時相性。HSYA可上調VEGF的蛋白表達,但與模型組比較未見顯著差異。 結論: 基因芯片結果提示內源性的促血管新生相關基因的表達在腦缺血后24h內經(jīng)歷了一個先下降后上調的動態(tài)過程,同時提示HSYA促血管新生早期的分子作用機制是一個多因子多通路參與的網(wǎng)絡化過程,其中對血管新生相關基因(如HIF-1α、VEGF、a
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