柞蠶Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制基因克隆及表達特征分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑(SPI)在生物體內能與絲氨酸蛋白酶相互制約,調節(jié)絲氨酸和半胱氨酸酶的活性,調節(jié)絲氨酸蛋白酶活性,形成一定的動態(tài)平衡,是一種調節(jié)劑,參與抗凝血、生殖、抑制過度自我吞噬、抗菌、免疫應細胞分化、凋亡、組織重建及免疫等重要過程。絲氨酸蛋白酶抑制劑根據(jù)分子中的疏水中心、形成二硫鍵的架橋結構、序列是否同源性相似和他們本身結構的緊湊性主要分為Hinudim家族、Stefins家族、Cystatins家族、Cysteine prot

2、einase inhibitors家族及Squash seed inhibitors家族等,為一類蛋白超家族。
  本研究基于前期柞蠶cDNA文庫獲得的部分序列設計引物利用RACE PCR方法克隆了柞蠶Kazal型絲氨酸蛋白酶抑制劑(Kazal-type.KSPI), ApKTSPI基因的cDNA序列并進行序列分析,柞蠶ApKTSPI基因的cDNA全長568 bp,含54 bp5’非編碼區(qū)和223 bp3’非編碼區(qū),開放閱讀框為2

3、91bp編碼96個氨基酸,含18個氨基酸(MKATTLIIFAVLFVAVNC)的信號肽和一個Kazal結構域。和印度柞蠶親緣關系最近,其次親緣關系比較近的是羅奴霉素毛蟲(Lonomia obliqua),而與半翅目、雙翅目及鱗翅目昆蟲的親緣關系較遠。利用實時定量PCR檢測到ApKTSPI基因在柞蠶5齡幼蟲的脂肪體中特異性的高表達,其次是馬氏管,而在表皮、血細胞、絲腺和中腸中表達量相對較低。分別用柞蠶核型多角體病毒(NPV)、細菌(Es

4、cherichia coli)和真菌(Beauveria bassiana)3種不同的病原物免疫刺激柞蠶5齡幼蟲,利用實時定量PCR檢測到柞蠶5齡幼蟲脂肪體中ApKTSPI基因在核型多角體病毒(NPV)、大腸桿菌(E. coli)和白僵菌(B. bassiana)免疫刺激后表達量都能上調,但上調的程度和時間都不同。利用表達載體pET28a構建了重組質粒pET28a-ApKTSPI,轉化大腸桿菌BL21后利用IPTG誘導表達,SDS-PA

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