RNA干擾技術沉默iNOS基因對宮頸癌細胞株增殖活性及VEGF表達的影響.pdf

1、宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，其發(fā)病率逐年上升、發(fā)病年齡呈年輕化的趨勢。晚期或復發(fā)性宮頸癌的預后很差，其臨床治療多采用手術、化療或放療等綜合性治療，雖然能夠取得一定的臨床療效，但由于病灶容易轉移和復發(fā)，最終的治療效果仍不理想，且伴有嚴重的不良反應。因此，尋找新的治療方法勢在必行。
　　新生血管是腫瘤賴以生長的基礎。腫瘤組織必須依賴血管提供營養(yǎng)，才能維持其生長，并實現(xiàn)瘤灶的血行性播散。
　　一氧化氮(nitric oxid

2、e，NO)是促進腫瘤血管形成的細胞因子，iNOS作為NO合成的關鍵酶，在多種惡性腫瘤中呈高表達，催化合成大量的NO，促進腫瘤血管的形成，影響腫瘤細胞的生長。既往的研究均表明iNOS的表達與腫瘤侵襲、轉移等密切相關。同樣，在宮頸癌組織中，iNOS的高表達與惡性程度和淋巴結轉移成正相關。
　　血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF) VEGF是已知的、腫瘤新生血管形成最重要、作

3、用最強的細胞因子，iNOS通過NO介導，在誘導VEGF促內皮細胞遷移和血管生成過程中發(fā)揮作用。
　　RNA干擾(RNA interfcrence，RNAi)是一種新近發(fā)展起來的基因沉默技術，由雙鏈RNA（dsRNA）引發(fā)，導致同源mRNA降解，從而阻止目的基因的表達。慢病毒作為一種介導siRNA或shRNA的較理想的載體，目前在干擾技術中被廣泛應用。
　　據(jù)此，采用RNA干擾技術抑制iNOS目的基因的表達，降低NO的合成，進

4、而下調VEGF水平，抑制腫瘤血管生成，為中晚期宮頸癌的治療模式提供新的思路和理論依據(jù)。
　　本課題分為三大部分:
　　1、iNOS基因RNAi慢病毒載體的構建;
　　2、iNOS—shRNA感染宮頸癌細胞株SiHa和HeLa的體外研究;
　　3、iNOS—shRNA對宮頸癌SiHa和HeLa細胞株生長影響的體內研究。
　　第一部分:iNOS基因RNAi慢病毒載體的構建及感染富頸癌SiHa和HeLa細胞株

5、r>　　[目的]體外構建iNOS基因RNAi慢病毒載體，感染宮頸癌SiHa和HeLa細胞株。
　　[方法]根據(jù)iNOS基因序列設計三條iNOS-shRNA，分別構建3個shRNA慢病毒表達載體，轉化感受態(tài)細胞，并通過PCR和測序進行鑒定。經鑒定正確后分別轉染293T細胞，進行慢病毒包裝，繼而感染宮頸癌SiHa和HeLa細胞株，后采用Western blot檢測目的蛋白的表達情況，判斷不同靶點的干擾效果。并采用熒光定量PCR技術進一

6、步驗證干擾結果。
　　[結果]PCR和測序證明質粒構建成功。感染宮頸癌SiHa和HeLa細胞后，鑒定出目的細胞的iNOS基因在mRNA水平和蛋白水平的表達均明顯下降。
　　[結論]構建的iNOS-shRNA慢病毒載體，感染宮頸癌細胞株SiHa和HeLa后，iNOS基因無論在mRNA水平還是在蛋白水平，其表達均明顯下降，從而證實了此表達載體的干擾效果。
　　第二部分慢病毒載體iNOS—shRNA感染宮頸癌細胞株的體外研究

7、
　　[目的]觀察iNOS—shRNA對宮頸癌細胞株SiHa和HeLa生長的影響，并在干擾后加入外源性不同濃度NO供體，探討iNOS，NO與VEGF的相關性。
　　[方法]將宮頸癌細胞株SiHa和HeLa分為三組，第一組感染iNOS—shRNA（干擾組），第二組感染隨機序列（陰性對照組），第三組未做處理（空白對照組）。MTT法檢測細胞增殖能力，流式細胞儀AnnexinⅤ-FITC/PI雙染檢測細胞凋亡。Griess法檢測細胞

8、上清的NO含量，ELISA檢測細胞上清液VEGF的水平，Real-timePCR和Western blot分別檢測各組細胞iNOS，VEGFmRNA和蛋白表達水平。陰性對照組和干擾組分別加入不同濃度NO供體-硝普鈉(SNP)，ELISA檢測細胞上清液VEGF的水平， Real-time PCR和Western blot分別檢測iNOS，VEGFmRNA和蛋白表達水平。
　　[結果]干擾組增殖速率降低，凋亡率增加，與陰性對照組和空白

9、對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。干擾組細胞上清液NO和VEGF的水平明顯降低，iNOS，VEGF的mRNA和蛋白表達水平均顯著下降，與其他兩組相比，差異有統(tǒng)計學意義。陰性對照組和干擾組分別加入不同濃度SNP，SNP在0-0.5mmol/L的濃度范圍，細胞上清液VEGF，VEGFmRNA和蛋白水平漸進性增加，且在SNP濃度為0.5mmol/L時達到峰值，SNP濃度繼續(xù)增至1.0mmol/L時，細胞上清液VEGF和VEGFmRNA和蛋白水平均

10、回落。加入不同濃度SNP，iNOS的mRNA和蛋白水平變化無統(tǒng)計學意義。
　　[結論]iNOS基因干擾后，宮頸癌細胞株SiHa和HeLa的生長受到抑制，細胞分泌NO和VEGF減少;iNOS和VEGF密切相關，iNOS對VEGF的作用是通過NO介導的。加入外源性NO后，在較低濃度范圍，能調節(jié)VEGF水平。
　　第三部分 iNOS—shRNA對宮頸癌細胞株(SiHa和HeLa)生長影響的體內研究
　　[目的]探討iNOS被

11、干擾后對人宮頸癌裸鼠皮下移植瘤生長的影響以及iNOS、VEGF表達變化的關系，進一步驗證前期試驗的結果。
　　[方法]體外培養(yǎng)宮頸癌細胞株SiHa和HeLa細胞，然后制成細胞懸液，注射于裸鼠前腋側皮下，觀察腫瘤形成，大小和重量變化。至移植腫瘤25天后犧牲裸鼠，取腫瘤組織做病理切片，用免疫組化法測各組腫瘤iNOS和VEGF的表達。
　　[結果]裸鼠皮下形成移植瘤，隨著時間延長逐漸增大。而干擾組腫瘤體積和重量小于對照組;其腫瘤組