蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌(Valsa mali)插入突變體的篩選及鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子(Vmzfp3)功能分析.pdf

1、近年來(lái)，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病在我國(guó)各個(gè)蘋(píng)果種植區(qū)普遍發(fā)生，嚴(yán)重威脅到蘋(píng)果產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。為了揭示蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的致病機(jī)理，從而為有效減少病害的發(fā)生提供理論依據(jù)，本試驗(yàn)借助西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家早區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期已經(jīng)建立的蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌ATMT突變體庫(kù)，采用離體枝條法，對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌的T-DNA插入突變體庫(kù)中的150個(gè)突變體進(jìn)行了致病力測(cè)定，經(jīng)過(guò)3次篩選得到了3個(gè)致病力明顯減弱的突變體，并通過(guò)基因組重測(cè)序的方法獲得致病相關(guān)基因，

2、并且對(duì)該基因的相關(guān)功能進(jìn)行了初步研究。論文主要結(jié)果如下:
　　1.采用離體枝條法對(duì)隨機(jī)選取的150株T-DNA插入突變體進(jìn)行表型以及致病力的測(cè)定，經(jīng)過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn)，與原始菌株03-8相比，篩選得到3株致病力明顯減弱的突變體，編號(hào)分別為X4379、X4368和X4468。11株菌落顏色發(fā)生了顯著變化，其中突變體X4132、X4356和X4571菌落正面背面均為褐色;突變體X4281、X4263、X4416、X4288、X4375、X

3、4573、X4392和X4625菌落正面灰白色，背面灰褐色;突變體X4379菌落正面背面均為黃褐色。11株突變體的氣生菌絲稀疏。
　　2.選取編號(hào)為X4379的突變體進(jìn)行基因組重測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示該突變體有兩個(gè)插入位點(diǎn)，分別是鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子3（Vmzfp3）和跨膜蛋白42（Vmtme42）。對(duì)這兩個(gè)基因分別進(jìn)行基因敲除。利用Double-joint PCR構(gòu)建基因敲除載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法對(duì)Vmzfp3和Vmtm

4、e42兩個(gè)基因進(jìn)行敲除，分別獲得了135和67個(gè)突變體，再對(duì)突變體進(jìn)行PCR及Southern Blot檢測(cè)，得到真正的基因缺失突變體各1個(gè)。
　　3.對(duì)兩個(gè)基因的敲除突變體分別進(jìn)行表型以及致病力的測(cè)定，研究結(jié)果顯示，與原始菌株03-8相比，Vmtme42的敲除突變體在菌落形態(tài)、菌落生長(zhǎng)速度以及致病力方面均沒(méi)有明顯差異。Vmzfp3的敲除突變體，菌落生長(zhǎng)速度明顯減慢，菌絲稀疏，枝條的致病力明顯減弱，這說(shuō)明Vmzfp3可能參與腐爛病