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文檔簡介
1、腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的腦腫瘤,與周圍組織分界不清,浸潤性生長,目前治療以手術(shù)切除為主,術(shù)后輔以放療、化療,但效果不理想。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤手術(shù)治療后,平均生存時間為12-18個月,一般不超過2年,而且近年來治療效果毫無進(jìn)展。尋找新的有效治療方法成為目前研究熱點(diǎn)。近年來,隨著免疫學(xué)及分子生物學(xué)的發(fā)展,膠質(zhì)瘤的基因治療和免疫治療受到大家的重視,樹突狀細(xì)胞疫苗成為治療顱內(nèi)腫瘤的最有希望的免疫治療方法。
樹突狀細(xì)胞(dendritic
2、cells,DC)是目前已知的人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的、專職抗原呈遞細(xì)胞,能捕獲、加工處理抗原,并將抗原信息呈遞給淋巴細(xì)胞,從而引起一系列免疫反應(yīng)。目前已有多種DC疫苗在實(shí)驗(yàn)中已取得良好的抗瘤效果。致敏DC的抗原有全腫瘤抗原、特異性抗原肽、腫瘤DNA或RNA等。DC最大的功能是能夠處理、呈遞腫瘤抗原給T淋巴細(xì)胞,促使T淋巴細(xì)胞識別腫瘤,產(chǎn)生殺瘤效應(yīng)。目前尚不清楚膠質(zhì)瘤的特異性抗原和相關(guān)抗原,因此DC呈遞的抗原激活T淋巴細(xì)胞效率低下。
3、 腦腫瘤干細(xì)胞最早由Ignatova提出,他發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中只有少數(shù)細(xì)胞具有不斷分裂增殖傾向,它們具有干細(xì)胞的生長特性,因此提出了腫瘤干細(xì)胞的概念。這些數(shù)量極少具有類似干細(xì)胞特性的細(xì)胞,它們具有自我更新、無限增殖、多潛能分化能力,是膠質(zhì)瘤產(chǎn)生和復(fù)發(fā)的根源。腦腫瘤干細(xì)胞表達(dá)CD133和Nestin,具有高致瘤性,Singh發(fā)現(xiàn)接種100個CD133+細(xì)胞就能在小鼠顱內(nèi)形成腫瘤,而接種105個CD133-細(xì)胞也未見腫瘤生長,由此可見膠質(zhì)瘤
4、干細(xì)胞具有很強(qiáng)的抗原性。
本實(shí)驗(yàn)用C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng),加入細(xì)胞因子EGF、bFGF進(jìn)行誘導(dǎo),制備膠質(zhì)瘤干細(xì)胞,光鏡下觀察其形態(tài),免疫熒光檢測特異性標(biāo)志物CD133和Nestin,并進(jìn)行分化及致瘤性觀察。從大鼠骨髓提取單核細(xì)胞,加入GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)成DC,用膠質(zhì)瘤干細(xì)胞凍融抗原致敏DC制備疫苗,經(jīng)尾靜脈注入荷瘤大鼠體內(nèi),能明顯延長大鼠的生存時間,病理切片可見較多的CD8+淋巴細(xì)胞浸潤。
5、 研究目的:
膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)的惡性腫瘤,手術(shù)難以切除干凈,術(shù)后容易復(fù)發(fā),術(shù)后放療、化療效果不理想,因此有必要尋找新的有效的治療方法。膠質(zhì)瘤的免疫治療受到大家的重視。樹突狀細(xì)胞是目前已知的人體內(nèi)功能最強(qiáng)大的、專職抗原呈遞細(xì)胞,樹突狀細(xì)胞疫苗已經(jīng)進(jìn)行臨床試驗(yàn),證實(shí)安全有效。腫瘤干細(xì)胞是腫瘤發(fā)生發(fā)展的根源,具有很強(qiáng)的抗原性。本實(shí)驗(yàn)用腫瘤干細(xì)胞致敏樹突狀細(xì)胞制備疫苗,研究其對荷瘤大鼠的保護(hù)作用,為樹突狀細(xì)胞疫苗的臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)
6、,為膠質(zhì)瘤的預(yù)防和治療提供新的途徑。
研究方法:
1.腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)、鑒定
C6大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞系快速解凍,用含有10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng),置于37℃,5%C02飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的C6細(xì)胞,接種于無血清培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基含2%B27、bFGF20 ng/ml及EGF20 ng/ml。免疫熒光檢測腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物CD133和Nestin,流式細(xì)胞儀檢測BTSC表
7、面分子。將10只裸鼠隨機(jī)分為A、B兩組,每組5只,分別于皮下注射腫瘤干細(xì)胞及C6細(xì)胞,觀察腫瘤形成情況,腫瘤切片行HE染色。免疫熒光檢測BTSC分化為成熟神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志GFAP。
2.DC的分離、培養(yǎng)及疫苗的制備
在無菌條件下沖洗大鼠骨髓腔,獲取組織懸液。用淋巴細(xì)胞分離液梯度離心,收集界面層單個核細(xì)胞。培養(yǎng)箱中孵育2小時,收集非粘附細(xì)胞。加入細(xì)胞因子GM-CSF(5ng/ml)和IL-4(5ng/ml),第1
8、2d天收獲成熟的DC。倒置相差顯微鏡下觀察其形態(tài)。將分離好的單細(xì)胞懸液離心,加入熒光素標(biāo)記的小鼠抗大鼠OX62單克隆抗體,另一組試管中加入用同樣熒光素標(biāo)記的同型抗體作為對照,流式細(xì)胞儀檢測OX62表達(dá)情況。制備兩種DC疫苗。取對數(shù)生長期的腫瘤干細(xì)胞及C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,分別懸浮成濃度5×106/ml。反復(fù)凍融,裂解物離心,腫瘤抗原與DC以3:1比例混合,37℃、5%C02、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h(抗原量以凍融前腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞數(shù)計(jì)算,樹突
9、狀細(xì)胞以細(xì)胞數(shù)計(jì)算),即獲得DC-BTSC疫苗及DC-C6疫苗。混合淋巴細(xì)胞反應(yīng):采用大鼠脾臟來源的淋巴細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,DC-BTSC、DC-C6及DC作為刺激細(xì)胞。分別設(shè)立反應(yīng)細(xì)胞及刺激細(xì)胞對照組。于酶標(biāo)儀上490nm處讀取OD值,計(jì)算刺激指數(shù)(SI)。SI=(混合反應(yīng)細(xì)胞孔OD值-刺激細(xì)胞孔OD值)/反應(yīng)細(xì)胞孔OD值
3.DC疫苗對荷瘤大鼠的治療作用研究
建立C6大鼠膠質(zhì)瘤模型,將C6細(xì)胞注射種植與大鼠
10、右側(cè)尾狀核區(qū)域。40只成年Wistar大鼠,隨機(jī)分成A、B、C、D四組,每組10只。7天后A組經(jīng)尾靜脈注射1×107DC-BTSC疫苗(體積100ul)、B組注射1×107DC-C6疫苗、C組為1×107DC,D組為PBS對照,共3次,每次間隔1周。所有荷瘤大鼠死亡后均行病理檢查,行HE染色及免疫組化檢測CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤情況。生存分析采用Kaplan-Meier方法,生存率比較采用Log-rank檢驗(yàn)。
結(jié)果:
11、> 1.C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞在無血清培養(yǎng)條件下,5~7天左右后形成細(xì)胞球,細(xì)胞多為透亮圓形,懸浮生長,折光性好。從無血清培養(yǎng)基中分離培養(yǎng)的腦腫瘤干細(xì)胞進(jìn)行熒光染色,可見CD133和Nestin染色陽性;在含血清培養(yǎng)基中,腫瘤干細(xì)胞分化后GFAP免疫熒光染色亦呈陽性表達(dá)。流式細(xì)胞儀顯示:誘導(dǎo)后的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞MHC-Ⅱ、CD80及CD86表達(dá)率為60%、51%、62%,顯著高于C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞的9%、6%、4%。A組接種腫瘤干細(xì)胞小鼠皮下可見
12、腫瘤長出。B組接種干細(xì)胞完全培養(yǎng)基中的貼壁細(xì)胞小鼠未見腫瘤長出。裸鼠成瘤速度與細(xì)胞密度密切相關(guān)。濃度越高,腫瘤生長越快。取出移植瘤后經(jīng)HE染色可見典型膠質(zhì)瘤組織。將BTSC重新接種于含血清培養(yǎng)基中,細(xì)胞球逐漸貼壁,四周伸出的許多細(xì)小突起;相互連接成網(wǎng)狀,貼壁分化的細(xì)胞形態(tài)與C6細(xì)胞一致。
2.樹突狀細(xì)胞培養(yǎng)的第2天可見培養(yǎng)基中的單個核細(xì)胞貼壁生長,第10天可見懸浮細(xì)胞明顯增多,細(xì)胞體積增大,從胞體周圍伸出多個長短不一的樹突
13、狀突起。流式細(xì)胞學(xué)檢查顯示OX62表達(dá)陽性率為86%。未經(jīng)誘導(dǎo)的單個核細(xì)胞OX62表達(dá)率低。MLR結(jié)果顯示:相同S:R比例下,DC-BTSC刺激淋巴細(xì)胞的增殖指數(shù)明顯高于DC-C6刺激的增殖指數(shù)(P<0.01),并且DC與淋巴細(xì)胞比例在1:10時刺激能力最強(qiáng),淋巴細(xì)胞增殖最明顯,隨著兩者比例增大或減少刺激能力減弱。
3.立體定向接種膠質(zhì)瘤后3周,可見大鼠一側(cè)大腦半球上腫瘤組織呈菜花樣向外生長,而接種DC-BTSC疫苗組大鼠
14、腦組織未見腫瘤生長。疫苗接種后45天后,取出腦組織行HE染色,A組未見明顯腫瘤細(xì)胞,其余組可見腫瘤細(xì)胞,有不同數(shù)量的核分裂相,瘤內(nèi)壞死。CD8+免疫組化染色見ABC三組均有CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤,其中A組最多,其次為B組,C組散在少量,D組未見CD8+T淋巴細(xì)胞浸潤。A組中位生存時間為(39±3.12)d,B組為(29±2.01)d,C組為(23±1.42)d,D組為(19±1.02)d。Log-rank檢驗(yàn):4組生存曲線差異總體比較差
15、異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01):A組與B、C、D組分別比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);B組與C、D組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;C、D組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
結(jié)論:
1.無血清培養(yǎng)基中加入細(xì)胞因子EGF、bFGF培養(yǎng)C6膠質(zhì)瘤細(xì)胞,可以獲得足夠數(shù)量的腫瘤干細(xì)胞。在含血清培養(yǎng)基中分化后可形成與C6一致的腫瘤細(xì)胞。
2.誘導(dǎo)后的腫瘤干細(xì)胞比誘導(dǎo)前的C6高表達(dá)MHC-Ⅱ、CD80、CD86表面分
16、子,抗原性更強(qiáng)。
3.腫瘤干細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞皮下接種裸鼠,可見腫瘤干細(xì)胞致瘤能力更強(qiáng),并且腫瘤生長速度與接種細(xì)胞濃度成正比。
4.從大鼠骨髓獲取DC前體細(xì)胞,經(jīng)淋巴細(xì)胞分離液分離后,梯度離心,用細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4聯(lián)合培養(yǎng),可以獲得足夠數(shù)量的DC。
5.在同種異體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)中,腫瘤干細(xì)胞致敏的DC與膠質(zhì)瘤細(xì)胞致敏的DC相比,刺激指數(shù)更高,S:R=1:10時,刺激指數(shù)最強(qiáng)
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