不可分型流感嗜血桿菌（NTHI）致宿主細胞炎癥反應的分子發(fā)病機制研究.pdf

1、本文主要就以下幾部分展開： 目的：通過不可分型流感嗜血桿菌與單核細胞相互作用，研究絲裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)信號傳導通路在不可分型流感嗜血桿菌(nontypeable haemophilus influenza，NTHI)致人體免疫細胞炎癥反應的作用。方法：NTHI為浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院臨床分離株，經血清學和16sRNA測序證實，外周血單核細胞分離自健

2、康成年人的靜脈血。NTHI與單核細胞共培養(yǎng)，1h、4h后收集細胞用Western Blot檢測p38、p44/42-MAPK的磷酸化；16h后用流式細胞儀檢測細胞表面TLR4的表達。預先用p38-MAPK抑制劑(SB203580)和p44/42-MAPK抑制劑(UO126)與單核細胞共孵育1h，然后加入NTHI(感染復數(shù)：200)，分別在4h、16h后收集上清，以酶聯(lián)免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子α(TNF-α)的水平。結果：NTHI能迅速

3、地誘導p38,p44/42-MAPK通路的磷酸化，并至少持續(xù)到刺激后4h。與未加細菌組比較，NTHI刺激16h后單核細胞表面TLR4受體表達明顯增加，上清中TNF-α增加(p<0.05)。與細菌攻擊組比較，阻斷p38-MAPK，而不是阻斷p44/42-MAPK通路，能顯著地降低單核細胞分泌。TNF-α(p<0.05)。結論：TLR4可能參與了NTHI致單核細胞炎癥反應；p38-MAPK是NTHI誘導單核細胞炎癥反應的關鍵信號分子。

4、 第二部分： 目的：通過建立呼吸道上皮細胞株的體外NTHI感染模型，確認NTHI在細胞內的存活，觀察NTHI及其組分(可溶性胞質成分SCF、外膜蛋白EP)對呼吸道上皮細胞MAPK信號傳導通路和后續(xù)的前炎癥因子表達的影響，并應用特異性ERK—MAPK抑制劑U0126、p38 MAPK抑制劑SB203580特異性阻斷下游MAPK信號傳導通路，觀察它們對呼吸道上皮細胞分泌前炎癥因子表達的影響。方法：NTHI系臨床分離株，經常規(guī)和基因

5、測序鑒定。NTHI與氣道上皮細胞共培養(yǎng)，透射電鏡觀察A549細胞內定植，12h后Triton破膜，再行培養(yǎng)證實細菌存活；westernblot檢測A549及BEAS-2B細胞p—p38和p-ERK MAPK蛋白的表達；超聲打碎細胞，超速離心分離NTHI可溶性胞質成分和外膜蛋白，流式細胞儀測定A549細胞NF-kBPp65的表達；ELISA測定A549和BEAS-2B細胞IL-8的表達。結果：NTHi在感染A549細胞4h后即有大量NTH

6、I進入胞內，且細胞內的NTHI數(shù)目與感染時間和細菌數(shù)目成正比；用Triton X-100破膜，對胞內細菌行體外培養(yǎng)，在巧克力平板上過夜后即見NTHI生長。Western blot顯示：NTHI刺激15rain-30min后，A549細胞內的p-p38和p-ERKMAPK表達開始增加；NTHI刺激15min-30min后，BEAS-2B細胞內的p-p38、p-ERKMAPK表達開始增加。流式細胞法顯示：NTHI和SCF、EP刺激4h后，A

7、549細胞內NF—rB p65的表達較培養(yǎng)基組明顯增強：與培養(yǎng)基對照比較，NTHI、SCF、EP組均明顯增強，其中完整NTHI作用最強。A549在NTHI刺激后IL-8分泌增加，可被SB203580抑制，但不被U0126抑制。BEAS-2B細胞在NTHI刺激后IL-8分泌增加，可部分被兩種MAPK抑制劑所抑制。結論：NTHI可以進入A549細胞并存活，是兼性的胞內菌：NTHI及其菌體成分對肺上皮細胞均有較強的致炎作用，完整細菌的作用最強

8、：p38MAPK、ERK MAPK和NF-KB均參與NTHI致氣道上皮炎癥反應，但MAPK參與NTHI致肺泡上皮細胞和支氣管上皮細胞的炎癥反應時的通路有所不同，p38可能是主要的信號傳導通路。 第三部分： 目的：通過建NTHI感染氣道上皮細胞的體外模型和小鼠的感染模型，研究NTHI誘導氣道上皮細胞和肺組織COX2和PGE2的表達，揭示Toll樣受體在NTHI致氣道上皮細胞和肺組織炎癥反應中的作用，同時闡明p38MAPK和

9、NF-kB兩條信號傳導通路的作用及兩者之間的關系。方法：用不同濃度的NTHI感染A549細胞以建立細胞體外感染模型。Western Not：檢測p38MAPK的磷酸化，電泳遷移率試驗測定NF-κB DNA結合活力，COX-1、COX-2 mRNA和PGE2蛋白的表達分別采用逆轉錄聚合酶鏈反應和酶聯(lián)免疫吸附試驗。用高表達TLR2和TLR4的HEK293細胞試驗以及用TLR2、TLR4基因敲除小鼠體內試驗，研究TLR2、TLR4在COX-2

10、表達中的作用。另外，用特異性分子抑制劑阻斷p38MAPK和NF-κB來揭示兩條信號傳導通路的作用。結果：在A549細胞NTHI誘導COX-2mRNA表達呈劑量相關性，但不影響COX-1 mRNA的表達。NTHI感染引起的PGE2表達增高可以被特異性的COX-2抑制劑所抑制，但不被COX-1抑制劑所抑制。NTHI誘導的COX-2表達在上皮細胞的體外試驗和肺組織的體內試驗中都是通過TLR2介導的。NTHI可以誘導p38 MAPK磷酸化和NF

11、-kB DNA結合活力的上調，COX-2和后續(xù)PGE2可以被p38 MAPK及NF-kB特異性抑制劑所阻斷；但是NTHI誘導的NF-κB DNA結合活力的上調不受p38 MAPK抑制劑的影響。結論：NTHI感染氣道上皮細胞是通過COX-2而非COX-1引起PGE2表達增高；無論是體外還是體內，TLR2是介導NTHI誘導COX-2和PGE2表達的主要表面受體；NTHI誘導COX-2和PGE2表達是通過p38MAPK及NF-κB兩條信號傳導