Galectin-3對(duì)子宮內(nèi)膜容受性建立過程中細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、胚胎著床涉及胚胎與母體子宮間極其復(fù)雜而精細(xì)的多因素相互作用。這個(gè)過程中，子宮內(nèi)膜僅在一個(gè)較短的時(shí)期允許成熟胚胎植入，這個(gè)時(shí)期稱為著床窗，這個(gè)時(shí)期子宮內(nèi)膜具有容受性，目前，子宮內(nèi)膜容受性形成的機(jī)理尚不清楚楚。在胚胎植入過程中，胚胎滋養(yǎng)細(xì)胞表現(xiàn)出與腫瘤細(xì)胞相似的侵襲能力，在具有容受性的子宮內(nèi)膜表面進(jìn)行粘附、入侵和植入。滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮內(nèi)膜的全程伴隨著子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡以及基質(zhì)細(xì)胞的蛻膜化。
　　 Galectin-3(Gal-3

2、)是本課題組前期篩選到的子宮內(nèi)膜容受性相關(guān)分子之一。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)其在子宮內(nèi)膜著床窗口期高表達(dá)，且在子宮內(nèi)膜異位癥患者在位內(nèi)膜的Galectin-3表達(dá)降低，可能與子宮內(nèi)膜容受性建立不全有關(guān)。目前對(duì)Galectin-3的研究主要集中在腫瘤方面，其在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、粘附、侵襲、凋亡等方面發(fā)揮著重要的生物學(xué)作用，這些生物學(xué)行為可能在胚胎植入過程中同樣起著巨大的作用。我們前期研究顯示，Galectin-3能夠調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的粘附和增殖。

3、鑒于Galectin-3功能的多樣性，我們對(duì)Galectin-3在母胎界面的其它生物學(xué)行為產(chǎn)生了興趣。既然Galectin-3通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡參與腫瘤細(xì)胞的侵襲，Galectin-3是否也在胚胎植入的過程中發(fā)揮了凋亡調(diào)節(jié)的作用呢?
　　 本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確Galectin-3在容受性子宮內(nèi)膜形成中的作用。運(yùn)用子宮內(nèi)膜局部沉默Galectin-3的方法研究其在著床中的作用，并用經(jīng)典的體外培養(yǎng)胚胎著床模型--

4、Bewo細(xì)胞株和RL95-2細(xì)胞株間接共培養(yǎng)模型，詳細(xì)地探討了胞內(nèi)及胞外Galectin-3對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)作用。論文分為以下三個(gè)部分：
　　 目的：明確Galectin-3對(duì)小鼠胚胎著床的影響。
　　 方法：收集早孕小鼠子宮內(nèi)膜，采用real-time PCR，免疫組織化學(xué)，Westernblot的方法檢測(cè)早孕小鼠子宮內(nèi)膜中Galectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)變化情況。帶免疫熒光oligo活體注射小鼠子宮角

5、，熒光顯微鏡下觀察活體轉(zhuǎn)染情況并用Western blot方法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染效果。孕鼠于孕9天被處死，研究轉(zhuǎn)染Galectin-3 siRNA對(duì)小鼠胚胎著床的影響。
　　 結(jié)果：Galectin-3 mRNA和蛋白在早孕小鼠子宮內(nèi)膜的表達(dá)高于未孕小鼠，Galectin-3 mRNA和蛋白水平分別在孕4天和孕2天達(dá)到高峰。免疫組化結(jié)果顯示：Galectin-3蛋白于孕6～8天腔上皮達(dá)高峰，于孕2～4天腺上皮達(dá)高峰。免疫熒光顯示：活體轉(zhuǎn)染

6、的siRNA進(jìn)入腔上皮細(xì)胞內(nèi)。孕4天蛋白檢測(cè)表明Galectin-3蛋白被Galectin-3 siRNA有效下調(diào)。孕9天處死小鼠，與對(duì)照組(NegaivesiRNA)相比，Galectin-3 siRNA注射側(cè)子宮角著床胚胎數(shù)明顯下調(diào)。
　　 結(jié)論：Galectin-3在早孕小鼠子宮內(nèi)膜周期性表達(dá)，并于著床期高表達(dá)，說明Galectin-3可能參與子宮內(nèi)膜容受性的形成。局部下調(diào)Galectin-3減少著床的胚胎數(shù)，說明Gale

7、ctin-3影響胚胎著床，可能是通過參與容受性子宮內(nèi)膜的形成起作用，其表達(dá)下調(diào)可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜容受性缺陷從而導(dǎo)致著床失敗。
　　 第二部分子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞內(nèi)Galectin-3的抗凋亡作用
　　 目的：探討子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞內(nèi)Galectin-3的抗凋亡作用。
　　 方法：用星胞霉素處理RL95-2細(xì)胞，MTT法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞活力的影響，吖啶橙染色免疫熒光檢測(cè)和AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀檢測(cè)的方法確定其對(duì)R

8、L95-2細(xì)胞凋亡的影響，運(yùn)用real-time PCR和Western blot的方法檢測(cè)Galectin-3表達(dá)變化情況。Galectin-3 siRNA轉(zhuǎn)染RL95-2細(xì)胞沉默Galectin-3表達(dá)，分析Galectin-3沉默后，星胞霉素對(duì)RL95-2細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用。Real-time PCR和Western blot檢測(cè)不同濃度雌、孕激素對(duì)RL95-2細(xì)胞Galectin-3表達(dá)調(diào)節(jié)情況。沉默Galectin-3表達(dá)后加

9、入雌、孕激素和星胞霉素檢測(cè)雌、孕激素是否通過調(diào)控Galectin-3表達(dá)來調(diào)節(jié)RL95-2細(xì)胞的凋亡。
　　 結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：星胞霉素處理后，RL95-2細(xì)胞活力降低，凋亡率上升，Galectin-3 mRNA和蛋白反應(yīng)性上升。Galectin-3 siRNA能有效下調(diào)RL95-2細(xì)胞Galectin-3表達(dá)。下調(diào)Galectin-3表達(dá)后，星胞霉素對(duì)RL95-2的凋亡促進(jìn)作用加強(qiáng)。雌、孕激素能有效上調(diào)RL95-2細(xì)胞Ga

10、lectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)。加入雌、孕激素后，Galectin-3被沉默的RL95-2細(xì)胞凋亡率高于加入Negative siRNA的對(duì)照組。
　　 結(jié)論：子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞胞內(nèi)Galectin-3具有抗凋亡作用。雌、孕激素能調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞中Galectin-3表達(dá)，雌、孕激素調(diào)控子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡，Galectin-3可能是這個(gè)凋亡途徑的下游分子之一。
　　 第三部分激素對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞Galectin-3

11、的調(diào)節(jié)以及胞外Galectin-3對(duì)子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用
　　 目的：探討激素對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞Galectin-3的表達(dá)及分泌調(diào)節(jié)以及Galectin-3在母胎界面對(duì)子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的凋亡調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：體外培養(yǎng)滋養(yǎng)細(xì)胞和子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞：Bewo和RL95-2細(xì)胞株，不同濃度雌激素、孕激素和人促絨毛性腺激素處理Bewo細(xì)胞。Real-time PCR、Western blot和ELISA的方法檢測(cè)三種激素對(duì)Be

12、wo細(xì)胞表達(dá)和分泌Galectin-3的影響。不同濃度重組蛋白Galectin-3作用于RL95-2細(xì)胞，BrdU法和AnnexinV/PI流式細(xì)胞儀的方法檢測(cè)其對(duì)RL95-2細(xì)胞增殖和凋亡調(diào)節(jié)作用。重組蛋白Galectin-3加入RL95-2細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)RL95-2細(xì)胞integrinβ1/β3的表達(dá)影響。共培養(yǎng)Bewo和RL95-2細(xì)胞，加入Galectin-3中和性抗體，進(jìn)一步明確Bewo細(xì)胞分泌的Galectin-3

13、蛋白對(duì)RL95-2細(xì)胞的凋亡促進(jìn)作用。
　　 結(jié)果：各個(gè)濃度雌、孕激素和人促絨毛性腺激素均能有效上調(diào)Bewo細(xì)胞Galectin-3 mRNA和蛋白表達(dá)，并促進(jìn)Bewo細(xì)胞分泌Galectin-3蛋白。Galectin-3重組蛋白促進(jìn)RL95-2細(xì)胞的凋亡，并上調(diào)細(xì)胞表面integrinβ1的表達(dá)，而對(duì)integrinβ3無影響。共培養(yǎng)Bewo細(xì)胞和RL95-2細(xì)胞發(fā)現(xiàn)RL95-2細(xì)胞的凋亡率明顯上升，而Galectin-3中和