可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、雖然只有5-10％重癥復(fù)發(fā)性哮喘對吸入激素?zé)o效，但由于其高死亡率和發(fā)病率仍引起人們的高度關(guān)注。對這類患者治療手段及其有限，因此迫切要求一些新的治療方法。研究證明腫瘤壞死因子(TNF-α)是一種具有廣泛生物學(xué)活性的前炎癥細(xì)胞因子，參與哮喘的多個(gè)病理生理過程。它可以增加細(xì)胞間的粘附分子表達(dá)，使中性粒細(xì)胞和嗜酸細(xì)胞向氣道內(nèi)遷移，釋放細(xì)胞毒素，導(dǎo)致氣道損傷，反復(fù)的氣道損傷修復(fù)又導(dǎo)致氣道重構(gòu)。初步研究證實(shí)以TNF抑制劑為代表的生物制劑可有效改善重

2、癥復(fù)發(fā)性哮喘的氣道高反應(yīng)性，肺功能及提高生活質(zhì)量并減少復(fù)發(fā)次數(shù)，成為近年來研究哮喘治療的一個(gè)熱點(diǎn)。 腺病毒是目前用于基因轉(zhuǎn)移最廣泛的載體之一，具有感染譜廣、安全性高、容量大、體外可操作性好等優(yōu)點(diǎn)。新型AdMax系統(tǒng)通過重組酶在真核細(xì)胞內(nèi)完成重組出毒，高效且穩(wěn)定，是目前最簡便快捷的腺病毒載體系統(tǒng)，利用重組腺病毒載體表達(dá)可溶性TNFRI，可以局部封閉氣道內(nèi)高濃度TNF-α，這對重度難治性哮喘的治療提供了一個(gè)新的選擇。通過霧化吸人方式

3、將目的基因轉(zhuǎn)入，這樣不僅可以保證使目的基因在肺臟局部發(fā)揮作用，還可以減小由體循環(huán)注人引起的副作用。 基于以上研究，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并制備攜帶人sTNFR1-IgGFc融合基因的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞系(HBE135-E6E7)及人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)，并對轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中sTNFR1-IgGFc的表達(dá)及拮抗TNF活性進(jìn)行檢測，研究其抑制氣道平滑肌細(xì)胞增殖的作用。同時(shí)建立慢性哮喘小鼠模型，研究經(jīng)鼻滴入重組腺病毒Ad-s

4、TNFR1-IgGFc治療哮喘的作用，以探索出一種治療重癥頑固性哮喘的新的方法，為其在臨床上應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。目前國內(nèi)外還未見TNFR1-IgGFc融合基因治療哮喘的報(bào)道。 本研究分以下二方面進(jìn)行對可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實(shí)驗(yàn)研究 第一部分：重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc融合基因構(gòu)建、表達(dá)及其拮抗TNF作用 一、研究方法： 設(shè)計(jì)上游引物：5'-ATGAGCTCATGGGCCT

5、CTCCACCGTGCCTG-3'引入SacI位點(diǎn)，下游引物：5'-ATGTCGACTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGG-3'引入SalI位點(diǎn)，以質(zhì)粒pBluescrip/TNFR1-IgGFc為模板，PCR擴(kuò)增sTNFRI-IgGFc基因，將PCR產(chǎn)物插入pGEM-T載體，轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌DH5α，提取質(zhì)粒，DNA測序正確后，以SacI及SalI雙酶切，回收1，332bp片段，插入穿梭載體pDC316的相同位點(diǎn)，以連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)

6、化DH5α感受態(tài)菌，提取質(zhì)粒，酶切鑒定。將穿梭質(zhì)粒pDC316-sTNFR1-IgGFc、輔助質(zhì)粒pBHGlox△E1，3Cre與脂質(zhì)體的混合物轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，重組產(chǎn)生Ad-sTNFR1-IgGFe，PER鑒定毒種正確后，進(jìn)行擴(kuò)增、純化，50％組織培養(yǎng)感染劑量法(TCID50)計(jì)算病毒滴度。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測病毒感染效率。RT-PER檢測sTNFR1-IgGFcmRNA表達(dá)，采用即用型SABC免疫組化染色試劑盒，以1:100稀釋的兔抗T

7、NFR1抗體為一抗，免疫組化法檢測sTNFR1-IgGFc蛋白表達(dá)，采用TNFR1ELISA檢測試劑盒檢測腺病毒轉(zhuǎn)染的人氣道平滑肌細(xì)胞(HASMCs)上清中sTNFR1-IgGFc蛋白表達(dá)量。以TNF敏感的L929細(xì)胞為靶細(xì)胞，加入倍比稀釋轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞上清及100μL含2ngTNF-α和2μg/mL絲裂霉素C，采用MTT法檢測表達(dá)sTNFR1-IgGFc的ItBE135-E6E7細(xì)胞上清對TNF-α的拮抗活性；采用MTT法檢測表達(dá)sT

8、NFR1-IgGFc的細(xì)胞上清對TNF-α促人氣道平滑肌細(xì)胞增殖能力的影響。 二、研究結(jié)果： 實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明成功構(gòu)建了Ad-sTNFR1-IgGFc腺病毒載體，感染性滴度達(dá)3×1010TCID50/ml，200moi轉(zhuǎn)染然人氣道上皮細(xì)胞陽性率為90.2％，轉(zhuǎn)染人平滑肌細(xì)胞陽性率達(dá)99.32％，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞在mRNA和蛋白水平均有sTNFR1-IgGFc表達(dá)。Ad-sTNFR1-IgGFc轉(zhuǎn)染后氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)的TNFR1蛋

9、白分泌到培養(yǎng)上清中，表達(dá)高峰在轉(zhuǎn)染后48h，表達(dá)量為11.3ng/ml，表達(dá)持續(xù)至少1周以上，轉(zhuǎn)染上清稀釋64倍后仍對TNF有拮抗活性。轉(zhuǎn)染上清對TNF-α的促平滑肌細(xì)胞增殖作用起顯著抑制作用。 三、研究結(jié)論： 構(gòu)建的重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc可有效轉(zhuǎn)染人氣道上皮細(xì)胞及人氣道平滑肌細(xì)胞，并在其中高效表達(dá)，轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清能拮抗TNF-α活性，同時(shí)可以抑制平滑肌細(xì)胞的增殖，為將表達(dá)sTNFR1-IgGFc腺病毒基

10、因治療哮喘的實(shí)驗(yàn)研究提供了基礎(chǔ)。 第二部分：可溶性腫瘤壞死因子1型受體基因轉(zhuǎn)染治療哮喘的實(shí)驗(yàn)研究 一、研究方法： 1、慢性哮喘小鼠模型建立24只4-6周SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分為生理鹽水霧化吸入組(A組)和哮喘模型組(B組)，Ad-GFP對照組(C組)，Ad-sTNFR1-IgGFc處理組(D組)，每組6只。制備慢性哮喘小鼠模型。哮喘模型組：首日致敏予腹腔內(nèi)，皮下注射10％OVA(卵蛋白)和10％氫氧

11、化鋁混合液1ml，第7日重復(fù)1次以加強(qiáng)致敏；2周后，將小鼠置入透明霧化吸入箱，予2.5％OVA霧化吸入(霧粒直徑3～5μm)，隔日1次，每次60min，連續(xù)4周。正常對照組：予等量生理鹽水腹腔注射以及生理鹽水霧化吸入，其余步驟同哮喘模型組。 2、Ad-sTNFR1-IgGFc腺病毒基因轉(zhuǎn)染小鼠，灌洗液收集及計(jì)數(shù)在誘導(dǎo)哮喘的第40天，A組不作任何治療，實(shí)驗(yàn)組(D組)經(jīng)鼻滴入Ad-sTNFR1-IgGFc100μl(1×109TCI

12、D50)病毒，對照組(C組)經(jīng)鼻滴入Ad-GFP100μl(1×109TCID50)病毒。所有小鼠繼續(xù)霧化OVA1次/天，每次60分鐘，連續(xù)2天，第3日處死小鼠行灌洗液的收集、細(xì)胞涂片的制作、細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類3、病理檢查及TNFRI在肺組織中表達(dá)檢測取小鼠右肺組織4％多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟切片、HE(蘇木素-伊紅)，AB/PAS(阿爾辛蘭-過碘酸雪夫)染色，光鏡下觀察細(xì)支氣管、肺組織病理變化。左肺組織采用RT-PCR檢測TNFR1-IgG

13、Fc的基因表達(dá)，免疫組化染色檢測TNFR1-Fc蛋白在肺組織中的表達(dá)，采用TNFR1原位雜交試劑盒檢測TNFRI表達(dá)二、研究結(jié)果：B、C、D三組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞均顯著高于A組(P<0.01)。而D組細(xì)胞總數(shù)低于B組和C組(P<0.01)。B組和C組嗜酸性細(xì)胞(EOS)數(shù)量顯著高于D組(P<0.01)，表明經(jīng)鼻吸入Ad-TNFRI-IgGFc對BALF中EOS及炎性細(xì)胞浸潤有顯著抑制作用。病理切片提示基因治療組小鼠較哮喘模型組及Ad-

14、GFP對照組在支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織炎癥明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，氣管平滑肌細(xì)胞增生減少，管腔縮窄不明顯，肺泡間隔無明顯增寬。AB/PAS染色提示哮喘模型組小鼠氣道周圍上皮有杯狀細(xì)胞增生，呈紫紅色，基因轉(zhuǎn)染治療組小鼠氣道周圍上皮杯狀細(xì)胞增生明顯減少。Ad-GFP對照組與哮喘模型組在炎性細(xì)胞浸潤及平滑肌細(xì)胞增生等方面無明顯差異。 二、研究結(jié)果： B、C、D三組細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞均顯著高于A組(P<0.01)

15、。而D組細(xì)胞總數(shù)低于B組和C組(P<0.01)。B組和C組嗜酸性細(xì)胞(EOS)數(shù)量顯著高于D組(P<0.01)，表明經(jīng)鼻吸入Ad-TNFRI-IgGFc對BALF中EOS及炎性細(xì)胞浸潤有顯著抑制作用。病理切片提示基因治療組小鼠較哮喘模型組及Ad-GFP對照組在支氣管、血管黏膜下和周圍肺組織炎癥明顯減輕，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減少，氣管平滑肌細(xì)胞增生減少，管腔縮窄不明顯，肺泡間隔無明顯增寬。AB/PAS染色提示哮喘模型組小鼠氣道周圍上皮有杯狀細(xì)

16、胞增生，呈紫紅色，基因轉(zhuǎn)染治療組小鼠氣道周圍上皮杯狀細(xì)胞增生明顯減少。Ad-GFP對照組與哮喘模型組在炎性細(xì)胞浸潤及平滑肌細(xì)胞增生等方面無明顯差異。 三、研究結(jié)論： 證實(shí)重組腺病毒Ad-sTNFR1-IgGFc可以經(jīng)鼻吸入高效轉(zhuǎn)染小鼠肺組織，經(jīng)免疫組化，原位雜交等方法證實(shí)其在氣道上皮及平滑肌細(xì)胞中高效表達(dá)sTNFR1-IgGFc。初步實(shí)驗(yàn)證明通過轉(zhuǎn)染可溶性TNF受體基因治療可以抑制哮喘氣道炎癥細(xì)胞浸潤和杯狀細(xì)胞增生，同時(shí)