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文檔簡介
1、本研究分為二部分:
第一部分:TRB3在ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制
目的:
1.人單核源性巨噬細(xì)胞中TRBs的表達(dá)情況;
2.ox-LDL對巨噬細(xì)胞TRB3的影響;
3.TRB3在ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡中的作用及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
方法:
本研究以原代培養(yǎng)的人單核源性巨噬細(xì)胞為研究對象,采用實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合
2、酶鏈反應(yīng)(real time RT-PCR)、蛋白免疫印跡(western blot)、酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)等實(shí)驗(yàn)方法,分別觀察:
1.在巨噬細(xì)胞自然分化第1、3、5、7、9、11天檢測TRB1, TRB2. TRB3mRNA表達(dá)水平;
2.不同濃度(0、5、10、25、5Oμg/ml)的ox-LDL, LDL處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間(0、4、8、12、24、48h)后,檢測TRB3 mRNA和蛋白含量;<
3、br> 3. TRB3基因克隆及腺病毒表達(dá)載體的構(gòu)建:根據(jù)Genebank人TRB3基因序列,設(shè)計(jì)引物,提取人全血DNA,PCR擴(kuò)增TRB3基因,回收目的基因并亞克隆至表達(dá)載體,經(jīng)測序鑒定正確后,應(yīng)用BD Adeno-X Expression System2腺病毒載體構(gòu)建系統(tǒng),構(gòu)建含人TRB3基因的腺病毒質(zhì)粒。經(jīng)轉(zhuǎn)染293細(xì)胞行病毒包裝、擴(kuò)增及純化,得到人TRB3腺病毒載體;
4.設(shè)計(jì)、合成、篩選TRB3 siRNA
4、;
5. TRB3腺病毒及siRNA分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,觀察ox-LDL刺激后巨噬細(xì)胞凋亡的變化(MTT檢測細(xì)胞存活率,ELISA法檢測凋亡細(xì)胞ssDNA含量,western blot檢測caspase-3);
6. TRB3腺病毒及siRNA分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞,觀察Akt, MAPKs及NF-κB信號(hào)通路的變化。
結(jié)論:
1.人單核源性巨噬細(xì)胞中TRBs的表達(dá)以TRB3為主,TRB3
5、主要分布于細(xì)胞核內(nèi);
2.ox-LDL呈劑量和時(shí)間依賴性刺激巨噬細(xì)胞合成TRB3;
3.TRB3部分參與ox-LDL誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡過程;
4.TRB3主要是通過抑制Akt、p38 MAPK/AP-1通路參與ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡;
5.NF-κB參與ox-LDL誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡,但不參與TRB3介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡過程
第二部分:CHOP/TRB3通路在巨噬
6、細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用
目的:
1.探討ox-LDL對人單核源性巨噬細(xì)胞CHOP, ATF4的調(diào)控作用;
2.觀察ER stress時(shí)巨噬細(xì)胞TRB3的表達(dá)變化;
3.探討巨噬細(xì)胞中TRB3與ATF4-CHOP的相互調(diào)節(jié)作用。
方法:
1.不同濃度(0、2.5、5、10、25,5Oμg/ml)的ox-LDL, LDL處理巨噬細(xì)胞不同時(shí)間(0、4、8、12
7、、24、48h)后,檢測CHOP, ATF4 mRNA含量;
2.2μg/ml衣霉素刺激人單核源性巨噬細(xì)胞不同時(shí)間(Oh、4h、8h、12h、24h、48h)后,檢測TRB3 mRNA的表達(dá);
3. CHOP表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,觀察ox-LDL刺激后TRB3 mRNA表達(dá)的變化;
4.構(gòu)建TRB3重組腺病毒和TRB3siRNA,轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,觀察TRB3過表達(dá)或抑制表達(dá)后CHOP mRNA
8、表達(dá)的變化。
結(jié)論:
1.ox-LDL呈劑量和時(shí)間依賴性促進(jìn)巨噬細(xì)胞CHOP、ATF4 mRNA表達(dá);
2.ox-LDL可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞發(fā)生ER stress;
3.巨噬細(xì)胞發(fā)生ER stress時(shí)以CHOP、ATF4的表達(dá)增加為主;
4.ER stress促進(jìn)巨噬細(xì)胞TRB3 mRNA的合成;
5.CHOP可促進(jìn)ox-LDL誘導(dǎo)的TRB3表達(dá),TRB3負(fù)
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