年齡相關(guān)性白內(nèi)障相關(guān)基因NDRG2和MRG15的功能研究.pdf

1、目的年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-relatedcataract，ARC)，是目前主要的致盲性眼病。世界范圍內(nèi)近半數(shù)的盲由ARC所導(dǎo)致。隨著人口老齡化趨勢(shì)明顯加劇，ARC的患病人數(shù)也將持續(xù)增加。雖然通過(guò)手術(shù)的方法可以對(duì)ARC進(jìn)行有效的治療，但不可避免的存在一些術(shù)后并發(fā)癥，而且治療花費(fèi)的資金也已成為世界各國(guó)沉重的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。因此，ARC發(fā)病機(jī)制的研究不但是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題，也具有重要的社會(huì)意義。 NDRG2(N-myedownst

2、reamregulatedgene2)是我校生化教研室近期克隆到的一個(gè)與細(xì)胞增殖、分化相關(guān)的新基因，它與衰老的相關(guān)性提示其可能在ARC的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用。MRG15(MORF4-relatedgeneonchromosome15)是我課題組在前期工作中，通過(guò)改良的消減雜交技術(shù)，從ARC與正常晶狀體上皮間篩選到的一個(gè)重要的差異表達(dá)基因。本實(shí)驗(yàn)將驗(yàn)證NDRG2和MRG15兩個(gè)基因在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)、觀察它們對(duì)氧化刺

3、激的反應(yīng)、以及在基因表達(dá)增加或抑制的情況下晶狀體上皮細(xì)胞功能的變化，研究NDRG2和MRG15在ARC中的相關(guān)功能，從基因水平探討白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)制，為ARC的防治提供新的思路和理論依據(jù)，并對(duì)這兩個(gè)基因的功能研究給予有益的補(bǔ)充。 內(nèi)容與方法: 1.NDRG2相關(guān)功能研究 (1)Ndrg2蛋白在人眼各組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)采用免疫熒光染色和Westernblot的方法，檢測(cè)Ndrg2蛋白在4，5和7月齡正常人胚胎眼和正

4、常成人眼各組織中的分布與表達(dá)。 (2)NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)采用免疫熒光染色、半定量RT-PCR和Westernblot的方法，分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)。 (3)培養(yǎng)人晶狀體上皮細(xì)胞(SRA01/04細(xì)胞)衰老模型的建立、鑒定及Ndrg2蛋白的表達(dá)采用H2O2長(zhǎng)期刺激SRA01/04細(xì)胞，建立細(xì)胞衰老模型，并用衰老相關(guān)指標(biāo)鑒定；用Westernbl

5、ot的方法，檢測(cè)Ndrg2蛋白在該細(xì)胞模型中的表達(dá)。 (4)NDRG2過(guò)表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響采用NDRG2重組腺病毒載體(Ad-NDRG2)感染SRA01/04細(xì)胞，并以L(fǎng)az重組腺病毒載體(Ad-Laz)作對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及對(duì)H2O2刺激反應(yīng)等方面的變化。 2.MRG15相關(guān)功能研究 (1)MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)采用半定量RT-PCR和Weste

6、rnblot的方法，分別從mRNA和蛋白水平檢測(cè)MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)。 (2)Mrg15在SRA01/04細(xì)胞衰老模型(H2O2長(zhǎng)期處理)中的表達(dá)變化H2O2處理SRA01/04細(xì)胞20d后，采用Westernblot檢測(cè)Mrg15表達(dá)的改變。 (3)Mrg15在H2O2短期處理SRA01/04細(xì)胞中的表達(dá)變化100μMH2O2無(wú)血清條件下處理SRA01/04細(xì)胞，用Westernblot檢測(cè)M

7、rg15蛋白于0，0.5，1，2，4，8，12和24h表達(dá)的改變。 (4)MRG15熒光表達(dá)載體的構(gòu)建及其在SRA01/04細(xì)胞中的表達(dá)用RT-PCR的方法，從人ARC前囊膜中擴(kuò)增人MRG15編碼基因，構(gòu)建EGFP融合表達(dá)載體pEGFP-N2-MRG15，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察Mrg15的細(xì)胞內(nèi)定位。 (5)MRG15真核表達(dá)載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達(dá)晶狀體上皮細(xì)胞株的建立采4用RT-PCR的方法，從人

8、ARC前囊膜中擴(kuò)增人MRG15基因編碼區(qū)全長(zhǎng)，構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)-MRG15，采用脂質(zhì)體法對(duì)SRA01/04細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，挑取單克隆，用Westernblot檢測(cè)Mrg15的表達(dá)。 (6)MRG15過(guò)表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響對(duì)穩(wěn)定表達(dá)MRG15的人晶狀體上皮細(xì)胞株進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞活力、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及對(duì)H2O2刺激反應(yīng)等方面變化的檢測(cè)。 (7)MRG15RNA干涉對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響

9、采用MRG15siRNA(shortinterferenceRNA)脂質(zhì)體法瞬時(shí)轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞，干涉內(nèi)源性MRG15的表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)及對(duì)H2O2刺激反應(yīng)等方面變化的檢測(cè)。 結(jié)果1.NDRG2相關(guān)功能研究(1)Ndrg2蛋白在人眼各組織發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)眼組織免疫熒光染色顯示，Ndrg2蛋白主要在細(xì)胞漿表達(dá)，在不同月齡胚胎眼及成人眼的角膜、虹膜睫狀體、晶狀體、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、鞏膜、視神經(jīng)和眼外肌等組織中均有表達(dá)，幾乎

10、分布于人眼各組織的各種主要組成細(xì)胞；用Westernblot進(jìn)行各組織Ndrg2定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Ndrg2在視網(wǎng)膜的表達(dá)在各月齡胚胎眼和成人眼間的差異不大，而在其他眼內(nèi)組織中，在胚胎后期或成人眼中，Ndrg2的表達(dá)較胚胎早期有不同程度的升高。 (2)NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)Ndrg2在ARC與正常人晶狀體上皮細(xì)胞漿中均有表達(dá)；在mRNA和蛋白水平，NDRG2在ARC前囊膜中的表達(dá)是正常人的2倍。 (3

11、)SRA01/04細(xì)胞衰老模型的建立、鑒定及Ndrg2蛋白的表達(dá)50μMH2O2處理SRA01/04細(xì)胞15～20d后，細(xì)胞出現(xiàn)典型的復(fù)制衰老表型，細(xì)胞群體中出現(xiàn)大量胞體平伏、體積增大的細(xì)胞，細(xì)胞活力下降、增殖力減弱、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽(yáng)性細(xì)胞達(dá)80％；Ndrg2蛋白表達(dá)明顯增高。 (4)NDRG2過(guò)表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響Ad-NDRG2感染SRA01/04后48hNdrg2蛋白表達(dá)明顯升高，細(xì)胞呈成纖維細(xì)胞樣變化，

12、細(xì)胞活力下降，凋亡細(xì)胞增加，H2O2刺激后細(xì)胞活力下降較對(duì)照組細(xì)胞明顯。 2.MRG15相關(guān)功能研究(1)MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達(dá)在mRNA和蛋白水平，MRG15在ARC前囊膜中的表達(dá)，分別增高到正常人的3倍和1.5倍。 (2)Mrg15在SRA01/04細(xì)胞衰老模型(H2O2長(zhǎng)期處理)中的表達(dá)變化在50μMH2O2處理SRA01/04細(xì)胞20d建立的細(xì)胞衰老模型中，Mrg15蛋白表達(dá)升高。

13、 (3)Mrg15在H2O2短期處理SRA01/04細(xì)胞中的表達(dá)變化SRA01/04細(xì)胞經(jīng)100μMH2O2處理后，細(xì)胞胞體回縮，形態(tài)似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞活力下降，細(xì)胞周期表現(xiàn)為G2/M期阻滯；8～24hMrg15的表達(dá)出現(xiàn)下降趨勢(shì)。 (4)成功構(gòu)建了熒光真核表達(dá)載體pEGFP-N2-MRG15，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SRA01/04細(xì)胞，Mrg15在細(xì)胞核表達(dá)。 (5)克隆了MRG15的編碼區(qū)全長(zhǎng)，成功構(gòu)建了真核表達(dá)載體pcDN

14、A3.1(+)-MRG15，并建立了穩(wěn)定表達(dá)MRG15的人晶狀體上皮細(xì)胞株。 (6)MRG15過(guò)表達(dá)對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響穩(wěn)定表達(dá)MRG15的人晶狀體上皮細(xì)胞株細(xì)胞生長(zhǎng)活力略有增加，細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡率及對(duì)H2O2刺激反應(yīng)等的變化與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異。 (7)MRG15RNA干涉對(duì)晶狀體上皮細(xì)胞的影響MRG15siRNA可以有效地封閉SRA01/04細(xì)胞MRG15的內(nèi)源性表達(dá)；MRG15干涉后，細(xì)胞表現(xiàn)為生長(zhǎng)活力下降，

15、細(xì)胞凋亡率增加，對(duì)H2O2刺激的敏感性增高。 結(jié)論: 1.NDRG2相關(guān)功能研究(1)Ndrg2蛋白廣泛表達(dá)于胚胎眼及成人眼各組織的各種主要組成細(xì)胞，且隨組織的發(fā)育成熟表達(dá)量升高，說(shuō)明Ndrg2在人眼的發(fā)育過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用； (2)發(fā)現(xiàn)了NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間存在mRNA與蛋白水平的差異表達(dá)； (3)采用H2O2長(zhǎng)期處理SRA01/04細(xì)胞成功建立了細(xì)胞衰老模型，并發(fā)現(xiàn)Ndrg2蛋白在

16、衰老細(xì)胞中呈高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)了NDRG2與晶狀體上6皮細(xì)胞衰老密切相關(guān)； (4)Ad-NDRG2感染SRA01/04細(xì)胞，可導(dǎo)致晶狀體上皮細(xì)胞生長(zhǎng)抑制，凋亡增加，對(duì)氧化刺激敏感性增加，提示NDRG2的過(guò)表達(dá)引起細(xì)胞功能的減退，對(duì)外界刺激易感，可能與ARC的形成有關(guān)。 2.MRG15相關(guān)功能研究 (1)進(jìn)一步證實(shí)了MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間存在差異表達(dá)； (2)Mrg15在SRA01/04細(xì)胞衰

17、老模型中的高表達(dá)說(shuō)明Mrg15與細(xì)胞衰老及ARC有一定的關(guān)系；而其在H2O2短期處理時(shí)的低表達(dá)，可能是通過(guò)不同的途徑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)； (3)Mrg15蛋白在SRA01/04細(xì)胞核內(nèi)的定位，驗(yàn)證了它是轉(zhuǎn)錄因子的推測(cè)； (4)MRG15過(guò)表達(dá)使SRA01/04細(xì)胞活力增強(qiáng)，干涉其內(nèi)源性表達(dá)細(xì)胞增殖力下降，對(duì)氧化應(yīng)激敏感性增加，這些提示MRG15可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞增殖的正向調(diào)節(jié)發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能； (5)MRG15在