年齡相關(guān)性白內(nèi)障相關(guān)基因NDRG2和MRG15的功能研究.pdf

1、目的年齡相關(guān)性白內(nèi)障(age-relatedcataract，ARC)，是目前主要的致盲性眼病。世界范圍內(nèi)近半數(shù)的盲由ARC所導(dǎo)致。隨著人口老齡化趨勢明顯加劇，ARC的患病人數(shù)也將持續(xù)增加。雖然通過手術(shù)的方法可以對ARC進行有效的治療，但不可避免的存在一些術(shù)后并發(fā)癥，而且治療花費的資金也已成為世界各國沉重的醫(yī)療負擔(dān)。因此，ARC發(fā)病機制的研究不但是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要課題，也具有重要的社會意義。 NDRG2(N-myedownst

2、reamregulatedgene2)是我校生化教研室近期克隆到的一個與細胞增殖、分化相關(guān)的新基因，它與衰老的相關(guān)性提示其可能在ARC的發(fā)生、發(fā)展中起一定的作用。MRG15(MORF4-relatedgeneonchromosome15)是我課題組在前期工作中，通過改良的消減雜交技術(shù)，從ARC與正常晶狀體上皮間篩選到的一個重要的差異表達基因。本實驗將驗證NDRG2和MRG15兩個基因在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達、觀察它們對氧化刺

3、激的反應(yīng)、以及在基因表達增加或抑制的情況下晶狀體上皮細胞功能的變化，研究NDRG2和MRG15在ARC中的相關(guān)功能，從基因水平探討白內(nèi)障的發(fā)病機制，為ARC的防治提供新的思路和理論依據(jù)，并對這兩個基因的功能研究給予有益的補充。 內(nèi)容與方法: 1.NDRG2相關(guān)功能研究 (1)Ndrg2蛋白在人眼各組織發(fā)育過程中的表達采用免疫熒光染色和Westernblot的方法，檢測Ndrg2蛋白在4，5和7月齡正常人胚胎眼和正

4、常成人眼各組織中的分布與表達。 (2)NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達采用免疫熒光染色、半定量RT-PCR和Westernblot的方法，分別從mRNA和蛋白水平檢測NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達。 (3)培養(yǎng)人晶狀體上皮細胞(SRA01/04細胞)衰老模型的建立、鑒定及Ndrg2蛋白的表達采用H2O2長期刺激SRA01/04細胞，建立細胞衰老模型，并用衰老相關(guān)指標(biāo)鑒定；用Westernbl

5、ot的方法，檢測Ndrg2蛋白在該細胞模型中的表達。 (4)NDRG2過表達對晶狀體上皮細胞的影響采用NDRG2重組腺病毒載體(Ad-NDRG2)感染SRA01/04細胞，并以Laz重組腺病毒載體(Ad-Laz)作對照，檢測細胞形態(tài)學(xué)、細胞活力、細胞周期、細胞凋亡以及對H2O2刺激反應(yīng)等方面的變化。 2.MRG15相關(guān)功能研究 (1)MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達采用半定量RT-PCR和Weste

6、rnblot的方法，分別從mRNA和蛋白水平檢測MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達。 (2)Mrg15在SRA01/04細胞衰老模型(H2O2長期處理)中的表達變化H2O2處理SRA01/04細胞20d后，采用Westernblot檢測Mrg15表達的改變。 (3)Mrg15在H2O2短期處理SRA01/04細胞中的表達變化100μMH2O2無血清條件下處理SRA01/04細胞，用Westernblot檢測M

7、rg15蛋白于0，0.5，1，2，4，8，12和24h表達的改變。 (4)MRG15熒光表達載體的構(gòu)建及其在SRA01/04細胞中的表達用RT-PCR的方法，從人ARC前囊膜中擴增人MRG15編碼基因，構(gòu)建EGFP融合表達載體pEGFP-N2-MRG15，瞬時轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞，熒光顯微鏡下觀察Mrg15的細胞內(nèi)定位。 (5)MRG15真核表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)定表達晶狀體上皮細胞株的建立采4用RT-PCR的方法，從人

8、ARC前囊膜中擴增人MRG15基因編碼區(qū)全長，構(gòu)建真核表達載體pcDNA3.1(+)-MRG15，采用脂質(zhì)體法對SRA01/04細胞進行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，挑取單克隆，用Westernblot檢測Mrg15的表達。 (6)MRG15過表達對晶狀體上皮細胞的影響對穩(wěn)定表達MRG15的人晶狀體上皮細胞株進行細胞形態(tài)學(xué)、細胞活力、細胞周期、細胞凋亡以及對H2O2刺激反應(yīng)等方面變化的檢測。 (7)MRG15RNA干涉對晶狀體上皮細胞的影響

9、采用MRG15siRNA(shortinterferenceRNA)脂質(zhì)體法瞬時轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞，干涉內(nèi)源性MRG15的表達，進行細胞生物學(xué)及對H2O2刺激反應(yīng)等方面變化的檢測。 結(jié)果1.NDRG2相關(guān)功能研究(1)Ndrg2蛋白在人眼各組織發(fā)育過程中的表達眼組織免疫熒光染色顯示，Ndrg2蛋白主要在細胞漿表達，在不同月齡胚胎眼及成人眼的角膜、虹膜睫狀體、晶狀體、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜、鞏膜、視神經(jīng)和眼外肌等組織中均有表達，幾乎

10、分布于人眼各組織的各種主要組成細胞；用Westernblot進行各組織Ndrg2定量檢測發(fā)現(xiàn)，Ndrg2在視網(wǎng)膜的表達在各月齡胚胎眼和成人眼間的差異不大，而在其他眼內(nèi)組織中，在胚胎后期或成人眼中，Ndrg2的表達較胚胎早期有不同程度的升高。 (2)NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達Ndrg2在ARC與正常人晶狀體上皮細胞漿中均有表達；在mRNA和蛋白水平，NDRG2在ARC前囊膜中的表達是正常人的2倍。 (3

11、)SRA01/04細胞衰老模型的建立、鑒定及Ndrg2蛋白的表達50μMH2O2處理SRA01/04細胞15～20d后，細胞出現(xiàn)典型的復(fù)制衰老表型，細胞群體中出現(xiàn)大量胞體平伏、體積增大的細胞，細胞活力下降、增殖力減弱、衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞達80％；Ndrg2蛋白表達明顯增高。 (4)NDRG2過表達對晶狀體上皮細胞的影響Ad-NDRG2感染SRA01/04后48hNdrg2蛋白表達明顯升高，細胞呈成纖維細胞樣變化，

12、細胞活力下降，凋亡細胞增加，H2O2刺激后細胞活力下降較對照組細胞明顯。 2.MRG15相關(guān)功能研究(1)MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間的差異表達在mRNA和蛋白水平，MRG15在ARC前囊膜中的表達，分別增高到正常人的3倍和1.5倍。 (2)Mrg15在SRA01/04細胞衰老模型(H2O2長期處理)中的表達變化在50μMH2O2處理SRA01/04細胞20d建立的細胞衰老模型中，Mrg15蛋白表達升高。

13、 (3)Mrg15在H2O2短期處理SRA01/04細胞中的表達變化SRA01/04細胞經(jīng)100μMH2O2處理后，細胞胞體回縮，形態(tài)似成纖維細胞，細胞活力下降，細胞周期表現(xiàn)為G2/M期阻滯；8～24hMrg15的表達出現(xiàn)下降趨勢。 (4)成功構(gòu)建了熒光真核表達載體pEGFP-N2-MRG15，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染SRA01/04細胞，Mrg15在細胞核表達。 (5)克隆了MRG15的編碼區(qū)全長，成功構(gòu)建了真核表達載體pcDN

14、A3.1(+)-MRG15，并建立了穩(wěn)定表達MRG15的人晶狀體上皮細胞株。 (6)MRG15過表達對晶狀體上皮細胞的影響穩(wěn)定表達MRG15的人晶狀體上皮細胞株細胞生長活力略有增加，細胞周期、細胞凋亡率及對H2O2刺激反應(yīng)等的變化與對照組相比無顯著差異。 (7)MRG15RNA干涉對晶狀體上皮細胞的影響MRG15siRNA可以有效地封閉SRA01/04細胞MRG15的內(nèi)源性表達；MRG15干涉后，細胞表現(xiàn)為生長活力下降，

15、細胞凋亡率增加，對H2O2刺激的敏感性增高。 結(jié)論: 1.NDRG2相關(guān)功能研究(1)Ndrg2蛋白廣泛表達于胚胎眼及成人眼各組織的各種主要組成細胞，且隨組織的發(fā)育成熟表達量升高，說明Ndrg2在人眼的發(fā)育過程中可能發(fā)揮重要作用； (2)發(fā)現(xiàn)了NDRG2在ARC與正常晶狀體上皮間存在mRNA與蛋白水平的差異表達； (3)采用H2O2長期處理SRA01/04細胞成功建立了細胞衰老模型，并發(fā)現(xiàn)Ndrg2蛋白在

16、衰老細胞中呈高表達，進一步證實了NDRG2與晶狀體上6皮細胞衰老密切相關(guān)； (4)Ad-NDRG2感染SRA01/04細胞，可導(dǎo)致晶狀體上皮細胞生長抑制，凋亡增加，對氧化刺激敏感性增加，提示NDRG2的過表達引起細胞功能的減退，對外界刺激易感，可能與ARC的形成有關(guān)。 2.MRG15相關(guān)功能研究 (1)進一步證實了MRG15在ARC與正常晶狀體上皮間存在差異表達； (2)Mrg15在SRA01/04細胞衰

17、老模型中的高表達說明Mrg15與細胞衰老及ARC有一定的關(guān)系；而其在H2O2短期處理時的低表達，可能是通過不同的途徑參與氧化應(yīng)激反應(yīng)； (3)Mrg15蛋白在SRA01/04細胞核內(nèi)的定位，驗證了它是轉(zhuǎn)錄因子的推測； (4)MRG15過表達使SRA01/04細胞活力增強，干涉其內(nèi)源性表達細胞增殖力下降，對氧化應(yīng)激敏感性增加，這些提示MRG15可以通過對細胞增殖的正向調(diào)節(jié)發(fā)揮其重要的生物學(xué)功能； (5)MRG15在