石蠟包埋肝細胞癌組織中RASSF1A、APC、WIF-1基因甲基化檢測及其臨床意義.pdf

1、目的：肝細胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是我國常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，近年來其發(fā)病率仍有上升趨勢，然而其確切的發(fā)病機制目前仍不十分清楚。隨著分子生物學的發(fā)展，抑癌基因甲基化在腫瘤形成和發(fā)展中的作用越來越受到重視。抑癌基因RASSF1A和APC分別是Ras和Wnt信號途徑中的分子，它們的甲基化在肝細胞癌發(fā)生中的作用以往已有一些研究報道，但是研究結論還很不一致，這兩個基因的甲基化檢測用于臨床還存在一定問

2、題；而抑癌基因WIF-1作為Wnt信號途徑中的另一個分子，其在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用及臨床意義的報道較少。抑癌基因RASSF1A，APC，WIF-1啟動子區(qū)域的甲基化檢測以往研究多采用新鮮組織，但新鮮組織長時間保存困難，大樣本、長周期的研究受到限制，因此，本研究以石蠟包埋的肝細胞癌組織為標本，采用甲基化特異性聚合酶鏈反應( methylation specific PCR，MSP)檢測RASSF1A，APC和WIF-1基因的甲基化狀

3、態(tài)，分析與臨床資料、病理學資料及生存期預后的關系，為抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1甲基化檢測的臨床應用提供理論依據(jù)，驗證石蠟包埋肝細胞癌組織中RASSF1A和APC基因的甲基化狀態(tài)的臨床意義，闡明WIF-1基因甲基化在肝細胞癌發(fā)生、發(fā)展中的作用，以期用于臨床診斷及預后判斷。
　　 方法：
　　 1 研究資料：收集自2002年1月～2010年6月于河北醫(yī)科大學第四醫(yī)院行肝膽外科手術治療的肝細胞癌組織97例，癌旁

4、肝硬化組織26例。97例肝細胞癌組織中男性81例，女性16例，年齡在24～75歲，平均年齡為55.69±10.21歲。所有標本常規(guī)石蠟包埋，HE染色，病理診斷由2名病理科醫(yī)師診斷證實。收集所有患者相關病史、實驗室檢查結果、臨床病理學資料和腫瘤家族史，通過電話聯(lián)系或信訪的方式對肝細胞癌患者隨訪其生存情況。
　　 2 抑癌基因啟動子區(qū)域的甲基化檢測方法：蠟塊組織總DNA采用傳統(tǒng)的酚-氯仿方法提取，經亞硫酸鹽處理后，用WizardDN

5、A純化試劑盒純化組織DNA，采用甲基化特異性PCR的方法對抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1進行目的片段的擴增，擴增產物通過電泳凝膠成像系統(tǒng)進行甲基化結果分析判定。
　　 3 統(tǒng)計學分析：所有數(shù)據(jù)均使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用x2檢驗或Fisher確切概率法，生存期采用Kaplan-Meier法計算，單因素分析采用Log-rank檢驗。均采用雙側檢驗，P＜0.05有統(tǒng)計學意義。
　　

6、結果：
　　 1 肝細胞癌和肝硬化組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化表達及比較
　　 RASSF1A基因的甲基化率在肝細胞癌組及肝硬化組中分別為67.01％(65/97)，42.31％(11/26)，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 APC基因在肝細胞癌組和肝硬化組中的甲基化率分別為63.92％(62/97)，42.31％(11/26)，兩組相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。<

7、br>　　 WIF-1基因在肝細胞癌組和肝硬化組中的甲基化率分別為46.39％(45/97)，7.69％(2/26)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。
　　 2 肝細胞癌患者中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化與臨床資料的比較
　　 RASSF1A基因的甲基化陽性率在男、女患者中的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。女性患者中APC基因甲基化陽性率為37.5％(6/16)，低于男性的甲基化陽性率69.14

8、％(56/81)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。WIF-1基因的甲基化陽性率女性為18.75％(3/16)，低于男性的甲基化陽性率51.85％(42/81)，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化陽性率與患者的年齡分組、肝功能Child-pugh分級和血清AFP值的大小間的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。HBsAg陽性組RASSF1A基因的甲基化陽性率為72.84％(59/81)，HBsA

9、g陰性組的甲基化陽性率為23.08％(3/13)，兩組間的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);APC和MF-1基因在HBsAg陽性和陰性組中的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。RASSF1A基因的甲基化陽性率在伴有肝硬化的組織中為71.11％(64/90)，顯著大于無肝硬化的組織14.28％(1/7)，兩組的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；APC及WIF-1基因中的甲基化陽性率在有無肝硬化組中的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

10、　　 3 肝細胞癌患者中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化與病理學資料的比較
　　 RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化陽性率與腫瘤的個數(shù)及腫瘤直徑無關(P＞0.05)。有假包膜組RASSF1A，APC基因的甲基化陽性率與無假包膜組的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);WIF-1基因的甲基化陽性率在有假包膜組為40％(30/75)，顯著低于無假包膜組68.18％(15/22)，兩組的差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.

11、05)。門脈瘤栓的有無及臨床分期兩組中三個基因的甲基化陽性率的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 4 肝細胞癌組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化陽性表達的相互關系
　　 97例肝細胞癌中三個抑癌基因均未甲基化的占11.34％(11/97)，至少有一個基因甲基化的占88.66％(86/97)，同時有兩個基因甲基化的占64.95％(63/97)，三個基因均發(fā)生甲基化的占23.71％(23/97)。采用P

12、earson相關分析肝細胞癌組織中RASSF1A，APC，WIF-1基因甲基化表達的關聯(lián)程度，發(fā)現(xiàn)三個抑癌基因甲基化表達均不存在相關關系(P＞0.05)。
　　 5 抑癌基因RASSF1A，APC，WIF-1的甲基化陽性表達與生存期預后關系
　　 對97例肝細胞癌患者進行電話或通信的方式隨訪其生存情況，隨訪至2011年3月，隨訪時間1～105月，其中9例患者失訪。該組1年、2年、3年生存率分別為57.3％，42.1％，3

13、5.4％。
　　 RASSF1A基因甲基化陰性的肝細胞癌患者1年、2年、3年生存率分別為56.3％，43％，39.7％，甲基化陽性者1年、2年、3年生存率分別為57.8％，40.1％，31.6％;APC基因甲基化陰性者1年、2年、3年生存率分別為54.3％，31.4％，25.7％，甲基化陽性者1年、2年、3年生存率分別為59％，46.8％，39.5％;WIF-1基因甲基化陰性者1年、2年、3年生存率分別為57.6％，45.6％，

14、37.3％，甲基化陽性者1年、2年、3年生存率分別為56.9％，35.7％，30.7％。單因素分析顯示，RASSF1A，APC，WIF-1基因的甲基化狀態(tài)間生存率比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。
　　 結論：
　　 1 石蠟包埋肝細胞癌組織中可檢測到RASSF1A，APC和WIF-1基因甲基化，檢測結果可靠，石蠟包埋組織的甲基化檢測有其可行性。
　　 2 肝細胞癌組織較肝硬化組織RASSF1A，APC，WI

15、F-1基因甲基化率高，提示抑癌基因RASSF1A，APC和WIF-1的甲基化在肝細胞癌的發(fā)生中起到一定作用。
　　 3 肝細胞癌組織中RASSF1A基因在HBsAg陽性組中的甲基化率高于HBsAg陰性組，在伴有肝硬化組中甲基化率高于不伴有肝硬化組，而APC和WIF-1基因的甲基化率與HBsAg感染和有無肝硬化無關，說明RASSF1A基因甲基化檢測有望用于肝細胞癌高危人群的篩查。
　　 4 抑癌基因RASSF1A，APC，