Bacillus amyloliquefaciens M1菌株生產的抗菌脂肽對耐藥性海洋病原弧菌抑菌活性的研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)在其生長過程中能產生多種脂肽類物質,具有顯著的抗細菌、抗真菌和抗支原體活性?？咕氖怯芍舅徭満碗逆渻刹糠謽嫵?兼具親水性和疏水性,這類物質種類多樣,結構各異。抗菌脂肽在農業(yè)生物防治、醫(yī)藥和環(huán)境治理等多個領域內具有巨大的應用潛力?？咕木哂袕V泛的抑菌活性,但是否對海洋病原弧菌有抑制作用呢?海洋動物弧菌病會對海水養(yǎng)殖造成重大的經濟損失。目前主要通過使用抗生素來防治海

2、洋動物弧菌性疾病,但抗生素容易使海洋環(huán)境中的微生物產生耐藥性,破壞海洋菌群的平衡。所以亟需尋找一種能殺死耐藥性病原弧菌的,天然且安全的抑菌物質來防治海洋動物的弧菌性疾病。
　　本研究中,M1菌株是一株分離自紅樹林的菌株,其次級代謝產物具有較強的抑菌活性。利用常規(guī)方法和分子生物學方法對M1菌株進行鑒定,該菌株被鑒定為解淀粉芽孢桿菌(B. amyloliquefaciens),這是一株在實際應用中比較安全的細菌。M1菌株可以對9種常見

3、的具有耐藥性的海洋病原弧菌產生抑菌活力。
　　為了降低M1菌株產抑菌物質的生產成本,利用廉價原料優(yōu)化了發(fā)酵培養(yǎng)基。最佳發(fā)酵條件為:豆餅粉1.0％(w/v),面粉1.5%(w/v),pH7.0,培養(yǎng)溫度為28℃,180 rpm振蕩培養(yǎng)24 h。完成了M1菌株在10-L發(fā)酵罐中的發(fā)酵實驗,M1菌株在發(fā)酵培養(yǎng)21 h時進入生長穩(wěn)定期,菌體量達到1.6×109 cells/mL,在第18 h時抑菌活力最大,抑菌圈直徑為34.0 mm、并測

4、定了淀粉酶活力(最高為48.7 U/mL)和蛋白酶活力(最高為2.3 U/mL)隨時間變化規(guī)律。通過酸沉淀、甲醇抽提,薄層層析和高效液相色譜法(HPLC)等手段對發(fā)酵上清液中的抑菌物質進行了分離和純化,獲得了抑菌物質NQ。質譜分析表明,抑菌物質NQ是表面活性素(surfactin),由Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu分別連接C12、C13、C14和C15的β-羥基脂肪酸構成的環(huán)狀脂肽。純化后的抗菌脂肽NQ最適作用溫

5、度是28℃,在20℃-40℃之間都有良好的穩(wěn)定性;在pH7.0-9.0之間抗菌脂肽的穩(wěn)定性較好,其最小抑菌濃度為12.5μg/mL。
　　對M1菌株純化后的抗菌脂肽的抑菌機理進行初步探究:純化后的抗菌脂肽不僅可以殺死完整的鰻弧菌細胞,還能殺死鰻弧菌細胞的原生質體,這說明抗菌脂肽可能是通過破壞細胞膜來殺死細菌的。電鏡檢測發(fā)現,被抗菌脂肽作用過的鰻弧菌細胞表面出現破損,細胞出現降解,細胞內容物釋放,導致細胞死亡,說明抗菌脂肽能破壞鰻弧