HBV YMDD變異檢測(cè)方法的建立及臨床應(yīng)用的初步研究.pdf

1、目的拉米夫定是近年用于抗HBV的主要藥物之一，它可明顯抑制HBV的復(fù)制，進(jìn)而達(dá)到控制炎癥、穩(wěn)定病情甚至阻止肝纖維化的進(jìn)展，但抑制病毒復(fù)制作用短暫，易于復(fù)發(fā)。隨著用藥時(shí)間的延長(zhǎng)，在藥物和人體免疫選擇壓力下可產(chǎn)生耐藥。YMDD是拉米夫定抗HBV治療最常出現(xiàn)變異的區(qū)域，一旦出現(xiàn)YMDD變異株，可能會(huì)伴有HBVDNA水平反跳和肝功能變化，甚至導(dǎo)致病情惡化。故開(kāi)展YMDD變異的檢測(cè)很有必要，對(duì)及時(shí)調(diào)整治療方案、合理用藥及提高療效具有重要意義。本實(shí)

2、驗(yàn)利用錯(cuò)配PCR擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行HBVP基因YMDD變異的檢測(cè)，以評(píng)價(jià)其臨床應(yīng)用價(jià)值，并對(duì)HBVP基因YMDD變異的臨床意義進(jìn)行初步探討。 方法采用基因擴(kuò)增技術(shù)檢測(cè)時(shí)，其中一條引物3'端第2位堿基與目的基因?qū)?yīng)的堿基不互補(bǔ)。根據(jù)YMDD變異的位點(diǎn)，分別設(shè)計(jì)不同的引物，擴(kuò)增出需要得到的不同變異位點(diǎn)的DNA片段。 1.應(yīng)用分子克隆方法建立陽(yáng)性對(duì)照系統(tǒng)，構(gòu)建YMDD、YVDD、YIDD的陽(yáng)性質(zhì)粒。 2.對(duì)所構(gòu)建的質(zhì)粒應(yīng)用P

3、CR方法、酶切鑒定及直接測(cè)序方法進(jìn)行鑒定，并且進(jìn)行敏感性及特異性試驗(yàn)。 3.對(duì)65例未經(jīng)抗病毒治療的乙型肝炎患者檢測(cè)其YMDD變異情況。 4.對(duì)30例經(jīng)拉米夫定治療一年，HBVDNA持續(xù)陽(yáng)性的患者，檢測(cè)其YMDD變異情況。 結(jié)果1.應(yīng)用PCR方法、酶切鑒定及直接測(cè)序方法證實(shí)構(gòu)建的YMDD、YVDD、YIDD質(zhì)粒序列正確。 2.YMDD、YVDD、YIDD質(zhì)粒具有較高的敏感性和特異性，三種質(zhì)?？蓹z測(cè)出的最低

4、濃度分別為1.87copies/μl、1.53copies/μl、1.53copies/μl。YMDD質(zhì)粒在濃度為1.87×109copies/μl、YVDD、YIDD質(zhì)粒在1.53×108copies/μl以下時(shí)不出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。 3.65例未經(jīng)拉米夫定治療的乙型肝炎患者中6例存在YMDD變異，陽(yáng)性率為9.07％。其中YIDD和YI/YMDD各1例，YVDD3例，YV/YMDD1例。出現(xiàn)變異者與未出現(xiàn)變異者的肝功能和HBVDN

5、A水平比較無(wú)明顯差異。 4.30例經(jīng)拉米夫定治療一年，HBVDNA仍為陽(yáng)性的患者，半年變異發(fā)生率為16.67％，分別是YVDD2例、YIDD1例、YI/YMDD2例；一年變異發(fā)生率為13.33％，分別是YIDD1例、YI/YMDD3例。出現(xiàn)變異與未變異者的肝功能和HBVDNA水平比較無(wú)明顯差異YMDD變異從年齡分布看，35歲以上出現(xiàn)變異明顯高于35歲以下者。 結(jié)論1.在未經(jīng)拉米夫定治療的患者中可以出現(xiàn)YMDD變異，表明抗

6、病毒藥物壓力不是導(dǎo)致HBVYMDD變異的唯一因素。 2.YMDD變異可發(fā)生在長(zhǎng)期使用拉米夫定治療無(wú)效的患者中，提示抗病毒藥物壓力仍是導(dǎo)致YMDD變異的重要因素。 3.拉米夫定治療一年無(wú)效患者中，半年時(shí)可出現(xiàn)YMDD變異，變異可隨時(shí)間推移而改變，變異發(fā)生后肝功能和HBVDNA水平并未出現(xiàn)明顯變化。 4.本研究建立的檢測(cè)YMDD變異方法的敏感性、特異性較好，具有操作簡(jiǎn)便、實(shí)用、成本低的優(yōu)點(diǎn)，可作為檢測(cè)YMDD變異的一