天麻酚性成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用研究.pdf

1、目的：課題組前期研究證明天麻具有較強(qiáng)的抗腦缺血再灌注損傷作用，并提示其作用機(jī)制與抗氧化損傷有關(guān)，其活性為一組脂溶性酚性成分。本研究以H2O2誘導(dǎo)損傷PC12細(xì)胞為細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型，對(duì)天麻3個(gè)提取物和15份單體成分進(jìn)行活性篩選，探討天麻酚性成分對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用，并初步探討其可能的作用機(jī)制。
　　 方法：⑴采用RPMI-1640培養(yǎng)基、含10％FBS和0.4％雙抗的常規(guī)培養(yǎng)條件對(duì)PC12細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)、傳代和凍存，并以

2、MTT法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法和臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法繪制其生長曲線，初步掌握PC12細(xì)胞的體外生長增殖特性。⑵采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測定細(xì)胞存活率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討研究用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞氧化損傷模型的適宜濃度。⑶采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測定細(xì)胞存活率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，探討研究用依達(dá)拉奉對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的有效濃度。⑷采用細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和MTT法測定細(xì)胞存活率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，評(píng)價(jià)天麻3個(gè)提取物和15份單體成分對(duì)H2O2

3、誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞氧化損傷模型的保護(hù)作用。⑸采用DCFH-DA熒光探針法、LDH酶標(biāo)法、硫代巴比妥酸酶標(biāo)法和T-SOD羥胺法，評(píng)價(jià)天麻活性成分對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞外LDH活性、LDH泄漏率、細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性的影響。
　　 結(jié)果：①從MTT法繪制的生長曲線得出，在本實(shí)驗(yàn)室96孔板常規(guī)培養(yǎng)的條件下，PC12細(xì)胞數(shù)量以100個(gè)/mL接種培養(yǎng)6d未達(dá)到平臺(tái)期，100000個(gè)/mL細(xì)胞接種3d即達(dá)到平

4、臺(tái)期，適宜的細(xì)胞接種濃度為6000、8000和10000個(gè)/mL細(xì)胞，確定選擇8000個(gè)/mL細(xì)胞的接種濃度在25 cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，繪制培養(yǎng)瓶培養(yǎng)PC12細(xì)胞生長曲線。從細(xì)胞計(jì)數(shù)法和臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法繪制的生長曲線得出，以8000個(gè)/mL的細(xì)胞濃度接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)到第4d長至約90％的覆蓋率，第5d時(shí)長滿，隨著細(xì)胞數(shù)量的不斷增多、生長空間減少，細(xì)胞發(fā)生接觸抑制和密度抑制。②40μmol·L-1-80μmol·L-1的H

5、2O2可使PC12細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，多數(shù)細(xì)胞突起收回，胞體變圓，部分變圓細(xì)胞成團(tuán)存在，胞體邊緣模糊，折光性減弱，貼壁能力降低;與正常組比較，40μmol·L-1-80μmol·L-1的H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞存活率在18.6％-66.0％的損傷（P＜0.01），氧化損傷PC12細(xì)胞的H2O2適宜濃度范圍在40μmol·L-1-80μmol·L-1。③依達(dá)拉奉在0.918 mmol·L-1(160μg·mL-1)給藥濃度下對(duì)50μmol·

6、L-1H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細(xì)胞存活率檢測結(jié)果:與正常組比較，50μmol·L-1 H2O2損傷PC12細(xì)胞2h后的模型組細(xì)胞存活率為26.9％（P＜0.01）;與模型組比較，依達(dá)拉奉在給藥濃度達(dá)到0.918 mmol/L時(shí)提高細(xì)胞存活率10.9個(gè)百分點(diǎn)(P＜0.01)。④天麻3個(gè)提取物及15份單體中，天麻EtOAc(20μg·mL-1)和8#(80μg·mL-1)對(duì)50μmol·L-1 H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)

7、胞損傷的形態(tài)改善最為明顯。細(xì)胞存活率檢測結(jié)果:與模型組比較，天麻EtOAc(20μg·mL-1)和8#(80μg·mL-1)分別提高細(xì)胞存活率14.7和9.9個(gè)百分點(diǎn)（P＜0.01），1#和6#也提高細(xì)胞存活率（P＜0.05或P＜0.01），其同濃度結(jié)果重復(fù)性差。⑤天麻EtOAc和8#對(duì)H2O2誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞內(nèi)ROS水平、細(xì)胞外LDH活性、LDH泄漏率、細(xì)胞內(nèi)MDA含量和SOD活性測試結(jié)果表明，與模型組比較，天麻EtOAc(80μg

8、·mL-1)和8#(40、80μg·mL-1)受試物組對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度降低差異明顯(P＜0.01);天麻EtOAc(20、40、80μg·mL-1)受試物組胞外的LDH活性明顯低于模型組（P＜0.05或P＜0.01），LDH泄漏率降低差異明顯（P＜0.05或P＜0.01），8#(40、80μg·mL-1)受試物組胞外LDH活性明顯高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），提高LDH泄漏率的差異明顯（P＜0.01）;天麻EtOAc(2

9、0、40、80μg·mL-1)受試物組降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量的趨勢明顯，其中40μg·mL-1組降低細(xì)胞內(nèi)MDA含量的差異明顯（P＜0.05）;天麻EtOAc(20、40μg·mL-1)和8#(20、40μg·mL-1)受試物組提高細(xì)胞內(nèi)的T-SOD活性差異明顯（P＜0.01），天麻EtOAc和8#的80μg·mL-1給藥組降低細(xì)胞內(nèi)T-SOD活性差異明顯(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：⑴在25 cm2培養(yǎng)瓶中以8000個(gè)/mL（

10、1600個(gè)/cm2）細(xì)胞懸液接種PC12細(xì)胞培養(yǎng)到第4d時(shí)的細(xì)胞最適宜細(xì)胞傳代、接種和凍存，其群體倍增時(shí)間介于12h至24h之間。⑵采用40μmol·L-1-80μmol·L-1的H2O2損傷PC12細(xì)胞2h可復(fù)制PC12細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型。⑶依達(dá)拉奉對(duì)H2O2損傷PC12細(xì)胞2h造成氧化應(yīng)激損傷模型的較佳保護(hù)濃度為0.918 mmol·L-1(160μg·mL-1)。⑷天麻酚性成分8#、1#、6#和天麻EtOAc提取物具有改善氧化損