硼替佐米對結腸癌細胞惡性生物學行為的作用及機制研究.pdf

1、背景:結腸癌(coloncancer,CR)是世界第三大腫瘤,也是我國最常見的九大腫瘤之一。由于結腸癌的發(fā)病因素與社會環(huán)境、生活方式以及遺傳背景等有關,所以在過去的20年中結腸癌患病人數持續(xù)增加,發(fā)病率不斷升高。結腸癌還可以引起腸梗阻、腸穿孔等嚴重的并發(fā)癥,即使經過常規(guī)放化療、手術等治療,但患者的5年無病生存率及晚期的生存質量并不理想。在早期手術后,及時治療以控制疾病發(fā)展,晚期及時采用藥物化療減少復發(fā)及轉移,可以提高結腸癌患者的生存率及

2、晚期的生存質量。硼替佐米(Bortezomib)是首個應用于臨床研究的蛋白酶體抑制劑。美國食品藥物管理局(FDA)在2003年批準硼替佐米用于治療進展期的多發(fā)性骨髓瘤患者。美國癌癥研究所用60株來自人類不同腫瘤的細胞,對硼替佐米進行了藥物試驗,發(fā)現(xiàn)其能強效地抑制細胞的增殖能力。這些腫瘤包括多發(fā)性骨髓瘤、前列腺癌、胰腺癌、腎細胞癌和鱗狀細胞癌。其作用機制的研究大多集中于核因子κB(NF-κB)途徑。目前有文獻報道,硼替佐米還可以通過PI3

3、K/Akt途徑對多發(fā)性骨髓瘤、胰腺癌和胃癌等癌癥產生抗腫瘤作用。通過對PI3K/Akt途徑的調控,可以有效的抑制腫瘤細胞的增殖和轉移,誘導腫瘤細胞的凋亡。目前在結腸癌中尚沒有硼替佐米通過對PI3K/Akt途徑的調控來影響結腸癌細胞增殖、凋亡、侵襲及遷移能力的相關報道。
　　目的:1研究硼替佐米對結腸癌細胞系HT-29惡性生物學行為的影響;
　　2.探討硼替佐米通過PTEN調控PI3K/Akt途徑及下游信號分子,影響結腸癌細胞

4、惡性生物學行為的機制。
　　方法:1.硼替佐米1-500nmol/L處理結腸癌HT-29細胞24h及48h,MTT法檢測細胞存活率及藥物IC50值;2.流式細胞術檢測經80nmol/L硼替佐米處理后HT-29細胞凋亡及周期的變化;3.細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗觀察硼替佐米對HT-29細胞侵襲及遷移能力的影響;4.激光共聚焦觀察E-cadherin在經硼替佐米處理后HT-29的亞細胞定位;5.Westernblot技術

5、檢測caspase-3,E-cadherin,p-Akt和PTEN蛋白表達水平變化;6.設計下調PTENshRNA序列,包裝慢病毒載體,感染HT-29細胞系。建立穩(wěn)轉細胞系,并用硼替佐米處理后,觀察PTEN下調后,藥物對細胞凋亡、侵襲及遷移能力的影響。
　　結果:1.硼替佐米以時間依賴方式抑制結腸癌HT-29細胞的增殖能力,48小時IC50值是82.43nmol/L;2.細胞凋亡實驗顯示藥物作用24小時后細胞開始出現(xiàn)凋亡,48小時

6、凋亡明顯。硼替佐米作用24小時后細胞周期明顯阻滯在G0/G1期;3.細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗顯示硼替佐米可以有效的降低HT-29細胞的侵襲及遷移能力;4.激光共聚焦試驗顯示:硼替佐米處理HT-29細胞后,E-cadherin出現(xiàn)膜漿轉位現(xiàn)象;5.Westernblot實驗顯示,80nmol/L硼替佐米處理結腸癌HT-29細胞后PTEN蛋白、E-cadherin蛋白表達水平隨時間的延長明顯增加,而p-Akt蛋白表達水平隨時

7、間的延長明顯下降;6.慢病毒干擾抑制PTEN基因的表達后,用硼替佐米處理HT-29細胞,比較HT-29細胞與未加藥物的HT-29細胞的凋亡、侵襲及遷移能力,結果顯示無明顯差異,但下調PTEN基因后HT-29細胞的侵襲及遷移能力與正常HT-29細胞相比明顯增強。Westernblot實驗顯示,硼替佐米處理結腸癌HT-29細胞后PTEN、p-Akt蛋白表達水平無明顯變化。
　　結論:硼替佐米可以抑制結腸癌HT-29細胞增殖、誘導細胞周