豬輪狀病毒四川株的分離與鑒定.pdf

1、豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)是全球養(yǎng)豬業(yè)引起仔豬腹瀉的主要病原之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)斷奶仔豬PoRV感染也較普遍，因此開(kāi)展該病的病原分離等防控技術(shù)研究具有重要意義。本研究對(duì)2012年四川成都某豬場(chǎng)的疑似PoRV感染的腹瀉病料進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，再進(jìn)行了病原分離，成功分離獲得一株輪狀病毒，并對(duì)該病毒的病毒特性進(jìn)行了研究。
　　1.病毒的分離鑒定與特性
　　將RT-PCR檢測(cè)陽(yáng)性的

2、腹瀉病料處理后接種到MA104細(xì)胞中，接毒中采用胰蛋白酶處理活化病毒的方法，60ug/ml胰酶敏化病毒液，并在維持液中使胰酶終濃度為6ug/ml。接毒后第一代便開(kāi)始出現(xiàn)CPE，但不典型，到第三代時(shí)接毒第2天便開(kāi)始出現(xiàn)CPE現(xiàn)象，出現(xiàn)死細(xì)胞，并且死細(xì)胞堆積到一塊;第3天出現(xiàn)明顯的病變特征，表現(xiàn)為細(xì)胞界限不清、圓縮、堆積呈菜花狀，細(xì)胞開(kāi)始脫落形成空泡區(qū)，直至第4天，大量的細(xì)胞死亡并脫落。將細(xì)胞分離病毒液連續(xù)傳至22代，每隔3代進(jìn)行PCR鑒定

3、，結(jié)果擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，表明分離出的病毒為PoRV，將其命名為SC-C。測(cè)定其TCID50表明病毒以10-7.57倍稀釋后50ul接種細(xì)胞后可導(dǎo)致半數(shù)細(xì)胞死亡。理化性質(zhì)鑒定表明，該分離毒株對(duì)乙醚和氯仿均不敏感，但將其置56℃水浴30min可將其滅活，證明其不耐熱。
　　2.VP7基因的克隆、測(cè)序與分析
　　本研究根據(jù)GenBank中豬輪狀病毒VP7全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異引物，對(duì)分離株的VP7進(jìn)行了全基因克隆測(cè)序與序列分

4、析。結(jié)果表明VP7基因全長(zhǎng)1061bp，編碼326個(gè)氨基酸，核苷酸序列與推導(dǎo)的氨基酸序列長(zhǎng)度與其它PoRV的VP7基因相同。將VP7序列同52株韓國(guó)分離的豬輪狀病毒毒株比較，核苷酸序列和氨基酸序列同源性都在99％以上，表明PoRV的VP7序列相對(duì)較保守。將其同其它9株G5血清型毒株進(jìn)行比對(duì)，核苷酸序列同源性為87.4％～99.8％，氨基酸序列同源性也高達(dá)92.6％～99.7％，而同其他血清型的核苷酸序列和氨基酸序列同源性均較低，由此可推

5、斷出，該分離株屬于G5血清型。利用生物信息學(xué)軟件VP7蛋白進(jìn)行分析，其相對(duì)分子量為37.018KD，等電點(diǎn)為4.86，不穩(wěn)定性系數(shù)為35.81，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性，脂溶指數(shù)為95.06，總平均親水性為0.072。該蛋白最大疏水指數(shù)為3.678，最小疏水指數(shù)為-2.400。預(yù)測(cè)VP7蛋白含有9個(gè)抗原位點(diǎn)，4-23位和32-54位存在2個(gè)跨膜區(qū)，推測(cè)此結(jié)構(gòu)與VP7蛋白作為輪狀病毒的主要中和抗原相關(guān)。PredicProtein預(yù)測(cè)該VP7蛋白二

6、級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占30.67％，β-折疊占32.52％，β-轉(zhuǎn)角占36.81％，其功能位點(diǎn)中包含1個(gè)N-糖基化位點(diǎn)，4個(gè)蛋白激酶C磷酸化作用位點(diǎn)，3個(gè)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化作用位點(diǎn)，1個(gè)酪氨酸激酶磷酸化作用位點(diǎn)和3個(gè)N-豆蔻酰化位點(diǎn)。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明VP7基因同國(guó)內(nèi)東北分離到的一株A組豬輪狀病毒(JL94)親緣性最近，其次與牛源A組輪狀病毒具有較近進(jìn)化距離。
　　3.病毒回歸試驗(yàn)
　　取3.75×106PFU/m(l)細(xì)胞分離P

7、oRV病毒液感染4日齡乳豬進(jìn)行動(dòng)物回歸試驗(yàn)，人工感染乳豬表現(xiàn)為感染3h后四處走動(dòng)、步態(tài)不穩(wěn)、拱背腹痛癥狀、呼吸急促，頻率為70次/min，到第5天出現(xiàn)腹瀉癥狀，呈黃色水樣腹瀉。剖檢可見(jiàn)各腸段脹氣明顯，十二指腸腸壁變薄，空腸明顯充血，可見(jiàn)明顯的出血點(diǎn)。腸系膜出現(xiàn)嚴(yán)重充血且腸系膜淋巴結(jié)腫大。取十二指腸，空腸，回腸，結(jié)腸段進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，均可見(jiàn)預(yù)期大小的條帶片段，由此可知各腸段均有PoRV感染。取感染豬腸及內(nèi)容物接種于MA104細(xì)胞，可

8、在第四天觀(guān)察到輕微的細(xì)胞病變，血清中和實(shí)驗(yàn)表明1∶23.47倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)PoRV陽(yáng)性血清能中和該病毒的致細(xì)胞病變作用。間接ELISA檢測(cè)感染后血清IgG可知乳豬口服病毒后產(chǎn)生較高滴度的IgG抗體水平，口服滅活病毒產(chǎn)生的抗體水平高于口服活病毒所產(chǎn)生的抗體水平，且每7d免疫能更好的誘導(dǎo)乳豬產(chǎn)生IgG抗體，并在21d時(shí)抗體水平達(dá)到最高。
　　本試驗(yàn)成功分離得到了一株輪狀病毒四川毒株，并對(duì)其VP7基因進(jìn)行克隆測(cè)序和分析。將其對(duì)4日齡的乳豬