PPAR激動劑與自體內皮祖細胞聯(lián)合治療急性心肌梗死大鼠的實驗研究.pdf

1、背景和目的: 冠心病(Coronary heart disease CHD)特別是急性心肌梗死(Acute MyocardialInfarction AMD是二十世紀以來至今的一個全球性的健康問題。隨著人們生活方式的改變，在包括我國在內的發(fā)展中國家，近年來急性心肌梗死的發(fā)病率和死亡率也在逐年上升。眾所周知，急性心肌梗死是由于冠狀動脈的急性閉塞所導致的，冠脈閉塞引起的缺血缺氧又導致了大量心肌細胞的喪失。由于心肌細胞分裂增殖的能力低

2、下，不能很好的修復壞死的心肌組織，將會導致心功能的一步步惡化，并且是心肌梗死后病人死亡率和住院率增加的主要原因。雖然心肌梗死被定義為血管性疾病，然而治療策略不能僅僅集中到血管治療還應該關注心肌治療來促進心肌再生改善預后。越來越多令人矚目的研究已經表明，心肌梗死后通過移植骨髓來源的CD34<'+>細胞或體外擴增培養(yǎng)的內皮祖細胞(endothelial progenitor cellsEPCs)可以促進缺血組織的血管再生，改善心臟左室功能。

3、以前的研究認為EPCs的這種治療作用是通過分化、增殖為新生血管來實現(xiàn)的，最近的報道認為EPCs在體外也可以轉分化為有功能的心肌細胞。并且證實，在小鼠心肌梗死模型中EPCs可以在體內分化為心肌細胞和平滑肌細胞(smooth muscle cells SMCs)，并且可能比單獨分化為內皮細胞更大程度的促進梗死區(qū)域的血流量。因此，內皮祖細胞移植治療心肌梗死可能通過促進血管和心肌再生成為一種新的理想治療方法。EPCs移植治療雖然已經取得了很大的

4、成功，然而單純的細胞移植有一定的局限性，移植細胞的存活和進一步分化成熟很大程度上決定了心功能的改善程度。因此，如果能在細胞移植期間積極改善EPCs的局部微環(huán)境，抑制炎癥反應，減少EPCs凋亡，增強其生存能力，將更能促進EPCs對梗死心肌的修復和再生作用。本實驗的目的：通過自體外周血內皮祖細胞移植并聯(lián)合過氧化物酶體增殖物活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor α，PPAR α)的人

5、工合成激動劑非諾貝特(fenofibrate)和過氧化物酶體增殖劑活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR γ)的人工合成激動劑羅格列酮(rosiglitazone)來治療大鼠急性心肌梗死，從而來評價非諾貝特及羅格列酮在聯(lián)合應用外周血EPCs移植治療急性心肌梗死的可行性和療效。并且通過本實驗來探索非諾貝特(力平之)及羅格列酮(文迪雅)在降血脂和降血糖以外的心血管保護作

6、用。 方法:選取鄭州大學醫(yī)學院動物實驗中心培育的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠(150-200g)為研究對象，飼以正常飲食。隨機分為四組，每組10只，分為心肌梗死對照組(組Ⅰ)、單純內皮祖細胞移植組(組Ⅱ)、非諾貝特與內皮祖細胞移植聯(lián)合治療組(組Ⅲ)、羅格列酮與內皮祖細胞移植聯(lián)合治療組(組Ⅳ)。用10﹪的水合氯醛腹腔麻醉大鼠，仰臥位固定在手術臺上，無菌心臟采血3ml，肝素抗凝，用磷酸二氫鹽緩沖液(phosphate

7、 buffer saline，PBS)稀釋1倍后，應用Ficoll密度梯度離心的方法獲得單個核細胞，種植于纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板上，體外培養(yǎng)擴增，獲得較純的EPCs，以5-溴-2′-脫氧嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine，BrdU)標記。結扎大鼠左冠狀動脈前降支，制造大鼠急性心肌梗死模型。組Ⅱ、組Ⅲ和Ⅳ組在心梗模型制備后，于梗死周邊區(qū)(心肌顏色蒼白區(qū)周邊)分六點注射內皮祖細胞，每點50μl，組Ⅰ只注射等量培養(yǎng)液。組

8、Ⅲ和組Ⅳ完成上述步驟24h后，分別以非諾貝特20mg/kg/day和羅格列酮4mg/kg/dav灌胃8周。8周后用二維超聲心動圖觀察大鼠心功能的改變，8道生理記錄儀測定血流動力學指標。然后處死大鼠，以免疫組化方法檢測心肌內移植的EPCs及大鼠心肌修復情況。 結果: (1)心肌梗死模型建立8周后，超聲可見EPCs移植組、EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組心功能得到明顯改善，射血分數(shù)(ejection

9、fraction,EF)、左室短軸縮短率(fractional shortening,FS)較對照組均有明顯提高(p<0.05)，且EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組提高更顯著(p<0.05)。 (2)血流動力學指標測定顯示：與對照組相比，EPCs移植組、EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組左室收縮壓(Ieft ventricularsystolic pressure,INSP)、壓

10、力變化速率最大值(±dp/dtmax)均明顯升高(p<0.05)，而左室舒張末壓(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)明顯降低(p<0.05)，且EPCs+非諾貝特聯(lián)合治療組和EPCs+羅格列酮聯(lián)合治療組改變更顯著(p<0.05)，提示左室收縮舒張功能均明顯改善。 (3)細胞移植8周后BrdU染色發(fā)現(xiàn)(圖5)，在組Ⅱ、組Ⅲ和組Ⅳ的心肌梗死區(qū)域內可見BrdU陽性移植細胞分布，

11、提示移植細胞在心肌組織內得以存活，部分細胞已結合到新生的血管壁上，參與了局部血管再生過程。而心肌梗死對照組(組Ⅰ)未見BrdU陽性細胞分布，且該組梗死區(qū)域纖維化明顯，無新生細胞。 結論: (1)本實驗證實可以通過外周血密度梯度離心法分離獲得單個核細胞，然后經過一系列體外培養(yǎng)過程獲得較為純化的內皮祖細胞。 (2)缺血心肌局部移植內皮祖細胞可以通過促進局部心肌組織血管新生，改善冬眠心肌和頓抑心肌的血供來修復梗死大鼠的