新型陽離子聚合物與脂質體用于基因與siRNA傳遞的研究.pdf

1、基因治療為一些基因引起的疾病提供了潛在的治療手段?；蜉d體方面，非病毒基因載體的安全性高、免疫原性低，越來越受到人們的重視，但相對病毒載體而言，非病毒載體的轉染效率通常都不高，體內穩(wěn)定性差等。針對非病毒載體轉染效率低，體內穩(wěn)定性差的問題，我們分別設計幾種新型陽離子聚合物和脂質體作載體，用于高效的基因與siRNA的傳遞。論文的研究工作主要分為以下四部分：
　　 1.超分子自組裝構建PEG化非病毒基因傳遞系統(tǒng)的研究
　　 為

2、了解決PEI/DNA復合物在體內穩(wěn)定性的問題，我們將雙親性PEG衍生物LD0-PEG通過疏水作用插入到PEI/DNA復合物內核，組裝成超分子納米顆粒復合物，以實現(xiàn)PEI/DNA復合物PEG化，從而提高其在體內應用的穩(wěn)定性。粒徑分析結果顯示，在高鹽和血清存在的情況下，PEI/LD0-PEG/DNA復合物具有較好的穩(wěn)定性。對PEI/LD0-PEG/DNA復合物的表面電位進行測定，結果顯示出其表面電位略低于PEI/DNA復合物，表明LD0-P

3、EG能夠屏蔽復合物表面的部分正電荷。體外轉染實驗顯示，在血清存在的條件下，PEI/LD0-PEG/DNA復合物仍然能保持較高的穩(wěn)定性。這表明，通過自組裝的方法將PEI/DNA復合物進行PEG化，能夠有效的提高其在血清中的穩(wěn)定性，并且仍然維持較高的轉染效率。
　　 2.以季戊四醇衍生物為核的樹枝狀高分子(PD-PAMAM)作為自殺基因載體的研究
　　 在基因治療中，自殺基因引起了人們的注意，其中以聚酰胺胺類樹枝狀聚合物(P

4、AMAM)作為載體的研究較少。我們先前合成了一種以季戊四醇衍生物為核的新型PAMAM(PD-PAMAM)，其中第五代的PD-PAMAM(G5 PD-PAMAM)是一種有效的基因載體。在此，我們以G5 PD-PAMAM為載體，用于攜帶自殺基因胞嘧啶脫氨酶(CD)的研究。瓊脂糖凝膠電泳實驗G5 PD-PAMAM能夠與pCD-EGPF-N1結合形成復合物，DLS顯示其粒徑大小100 nm左右。體外實驗顯示復合物在人類腫瘤細胞系KB、HepG2

5、和A549細胞中具有較好的轉染效率。5FC敏感試驗結果表明G5 PD-PAMAM介導的CD自殺基因轉染，能夠將低量的5氟胞嘧啶(5FC)轉化為5氟尿嘧啶(5FU)，在很短的時間內誘導細胞死亡。與5FU相比，G5 PD-PAMAM介導的CD/5FC系統(tǒng)更能有效地引起細胞死亡。這些結果表明，G5 PD-PAMAM介導的自殺基因系統(tǒng)能夠使CD基因在人源腫瘤細胞系內高效的表達。
　　 3.以季戊四醇衍生物為核的樹枝狀高分子(PD-PAM

6、AM)作為siRNA載體的研究
　　 RNAi在疾病治療中有著巨大的應用前景，但如何有效傳遞siRNA仍然是此研究中的瓶頸。在前期的實驗基礎上，我們選用G5 PD-PAMAM作為siRNA的載體，為siRNA的載體提供一種新的思路。瓊脂糖凝膠電泳阻滯實驗顯示G5 PD-PAMAM與siRNA能夠以較低的質量比(0.5:1)形成復合物，顯示出G5PD-PAMAM與siRNA分子之間較強的復合能力。原子力顯微鏡顯示復合物的粒徑大小為

7、40-70 nm。體外實驗顯示G5 PD-PAMAM/siRNA不存在細胞毒性，并能夠有效的介導Luc-siRNA抑制熒光素酶的表達。通過細胞生物學的手段確定G5 PD-PAMAM/siRNA納米復合物顆粒主要以通過clathrin(網格蛋白)介導的細胞內吞途徑進入細胞。用分子信標(Molecular Beacon，MB)研究siRNA的釋放，結果顯示siRNA能夠有效的從G5 PD-PAMAM中釋放出來。
　　 4.脂肪胺構建

8、的新型納米脂質體作為siRNA載體的研究
　　 以脂質分子為基礎的siRNA載體的研究不斷有新的進展，如被稱為lipidoids的新型類脂類材料。Avridine是一種具有免疫活性的脂肪胺類分子，目前已經用于制備脂質體，它還未被運用到傳遞siRNA的陽離子納米載體的研究中。我們將Avridine與DOPE或Span80、和TPGS通過不同比例構建成新型的納米載體(LANC)，測定了不同LANC的經粒徑、電位和對siRNA的包封率

9、，確定LANC-DOPE為合適的載體。體外轉染結果顯示，含5％ TPGS的LANC-DOPE能夠有效介導Luc-siRNA抑制熒光素酶的表達。通過轉染具有熒光標記的siRNA和MB研究細胞對LANCs/siRNA復合物的攝取和復合物對siRNA的釋放。我們的研究為設計新型免疫脂質體作為siRNA載體提供了一種新的思路。
　　 綜上所述，具有高效安全的基因載體需要在材料設計上取得突破。實驗中，我們針對提高載體與基因或siRNA的相