甲氨喋呤對純化小鼠破骨細胞活性及凋亡影響的研究.pdf

1、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一類原因不明的慢性、進行性自身免疫疾病，以關(guān)節(jié)慢性炎癥為主要表現(xiàn)，炎癥關(guān)節(jié)局部常常有嚴(yán)重的關(guān)節(jié)破壞和骨丟失。關(guān)節(jié)骨質(zhì)侵蝕成為近年米RA研究的特點之一，對RA的治療側(cè)重于快速有效控制病情，阻止長期病情對關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)和功能的損壞，抑制破骨細胞性骨破壞和炎癥性骨丟失。RA病灶部位有大量的成熟破骨細胞提示破骨細胞是導(dǎo)致關(guān)節(jié)侵蝕的主要細胞，其數(shù)量和功能決定了RA關(guān)節(jié)破壞與骨丟失的嚴(yán)重程

2、度。甲氨喋呤(Methotrexate，MTX)是治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的首選藥物，可調(diào)節(jié)患者的異常免疫功能，在關(guān)節(jié)炎的病理改變上，MTX可減少骨質(zhì)侵蝕，阻止或延緩關(guān)節(jié)破壞，減少殘疾，對早期控制病程進展比較有益。但小劑量MTX治療RA的機制仍然不是很清楚。本實驗分析研究了MTX對小鼠破骨細胞的影響，試圖揭示MTX控制類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎骨破壞以破骨細胞為靶細胞的可能作用機制，為MTX的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。 本文采用MC3T3-E1小鼠成

3、骨細胞株與C57BL/6小鼠原代骨髓細胞共培養(yǎng)體系。MC3T3-E1小鼠成骨細胞株傳代培養(yǎng)后，消化重懸。6～8周齡雄性C57BL/6小鼠處死后，無菌取股骨和脛骨，收集骨髓單核細胞，加入培養(yǎng)液重懸。在培養(yǎng)皿中分別加入密度為1×106cells·mL-1的MC3T3-E1及密度為2×107 cells·mL-1的骨髓前體細胞共培養(yǎng)。兩天后半量換液，并加入終濃度280 ng·mL-1的IL-1β和終濃度10 ng·mL-1的M-CSF誘導(dǎo)破骨

4、細胞生成，繼續(xù)培養(yǎng)2大收集破骨細胞，置于新的培養(yǎng)皿中進行純化培養(yǎng)。分別設(shè)置空白對照組，IL-1β對照組，IL-1β聯(lián)合濃度為0.01～10umol·L-1的MTX用藥組，觀察藥物對純化破骨細胞的作用。研究采用MTT法測定甲氨喋呤對破骨細胞增殖作用的影響；流式細胞術(shù)測定甲氨喋呤對破骨細胞調(diào)亡的影響；RRAP染色和骨吸收陷窩染色記數(shù)、骨吸收陷窩面積測定分別觀察甲氨喋呤對破骨細胞活性及功能的影響；收集48h細胞培養(yǎng)上清，ELISA法測定甲氨喋

5、呤對破骨細胞MMP-9分泌的影響；提取破骨細胞RNA，RT-PCR法測定甲氨喋呤對破骨細胞中MMP-9、RANK基因表達的影響。 結(jié)果：光鏡下，觀察共培養(yǎng)體系的細胞形態(tài)，可見純化的破骨細胞表現(xiàn)出體積大、多核、偽足以及TRAP染色陽性等破骨細胞特征。骨片上，形成典型的骨吸收陷窩以及破骨細胞肌動蛋白環(huán)，證明本次實驗建立的共培養(yǎng)體系可以成功誘導(dǎo)出具有骨吸收功能的破骨細胞。 MTT法測定破骨細胞增殖的結(jié)果表明，MTX對破骨細胞增殖的抑制

6、作用，呈現(xiàn)出一定的劑量依賴性，隨著濃度的升高，其抑制作用增強。0.01gmol·L-1的MTX對破骨細胞活性沒有抑制作用。0.1～101xmol·L-1MTX都具有抑制破骨細胞增殖的作用，其中0.1μmol·L-1和1μmol·L-1的MTX處理組的破骨細胞增殖水平顯著低于空白對照組，10μmol·L-1MTX處理組的破骨細胞增殖水平最低，與空白對照組相比差異極顯著。 流式細胞術(shù)測定破骨細胞凋亡結(jié)果表明，IL-1β顯著抑制破骨細

7、胞凋亡。MTX處理組則表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)破骨細胞凋亡作用，0.01μmol·L-1和0.1μmol·L-1的MTX處理組，破骨細胞凋亡比例略低于空白對照組，但是仍然高于IL-1β處理組，表現(xiàn)出誘導(dǎo)破骨細胞凋亡作用。1μmol·L-1和10μmol·L-1的MTX可以完全拮抗IL-1β的抑制凋亡作用，破骨細胞凋亡比例顯著增加，甚至高于空白對照組，證明隨著濃度升高，MTX誘導(dǎo)破骨細胞凋亡的作用增強。Hoechst染色法進行破骨細胞凋亡形態(tài)學(xué)觀

8、察，其結(jié)果也顯示出同樣的趨勢。 ELISA法測定破骨細胞MMP-9分泌結(jié)果表明，MTX只在較高濃度水平對IL-1β刺激的MMP-9分泌有抑制作用，在低濃度水平則沒有作用甚至出現(xiàn)相反的作用趨勢。 破骨細胞骨吸收功能測定結(jié)果表明，IL-1β處理組破骨細胞計數(shù)，骨吸收陷窩計數(shù)，骨吸收陷窩平均面積以及骨吸收陷窩總面積，四個指標(biāo)均高于空白對照組，表明IL-1β可以顯著提高破骨細胞骨吸收功能。MTX處理組，在這四個指標(biāo)上均可拮抗IL

9、-1β作用，顯示出抑制破骨細胞骨吸收功能結(jié)果，其抑制作用呈現(xiàn)出一定的濃度依賴性。 對RT-PCR電泳圖像的分析結(jié)果表明，IL-1β可顯著刺激破骨細胞中RANK、MMP-9的mRNA的表達。MTX在0.01μmol·L-1至10μmol·L-1時均可抑制IL-1β對破骨細胞RANK的mRNA表達的刺激作用，在1μmol·L-1至10μmol·L-1其抑制作用與IL-1β對照組相比差異顯著。MTX只在1μmol·L-1至10μmol

10、·L-1時對IL-1β刺激的破骨細胞MMP-9的mRNA表達具有抑制作用。 綜上所述，本研究結(jié)果顯示，IL-1β顯著抑制破骨細胞凋亡并增強其骨吸收功能。同時可顯著刺激破骨細胞中RANK、MMP-9的mRNA的表達，在破骨細胞培養(yǎng)48h時，可顯著刺激破骨細胞金屬基質(zhì)蛋白酶MMP-9的分泌，在破骨細胞分化激活中具有重要作用。MTX可拮抗IL-1β對破骨細胞的作用，對IL-1β誘導(dǎo)生成的破骨細胞，具有抑制細胞增殖，誘導(dǎo)細胞凋亡，顯著促