鋅指蛋白Zfx在人腦膠質瘤腫瘤干細胞自我更新和抗凋亡機制研究.pdf

1、第一部分鋅指蛋白Zfx在人腦膠質瘤中的表達與意義
　　 目的:X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細胞和成體干細胞自我更新的共同分子基礎，Zfx在人腦膠質瘤中的表達及其與人腦膠質瘤的發(fā)生和惡性程度的關系有待探討。
　　 方法:收集52例經(jīng)病理證實的人腦膠質瘤腫瘤標本和8例正常腦組織標本，根據(jù)病理結果對人腦膠質瘤標本進行分組，通過實時定量PCR、免疫組織化學和免疫蛋白印跡等方法對標本中Zfx的

2、mRNA和蛋白表達進行檢測，應用統(tǒng)計學方法對正常腦組織和不同惡性程度人腦膠質瘤中Zfx的表達進行分析。
　　 結果:免疫組化染色結果顯示，Zfx 主要表達于細胞核。人腦膠質瘤中Zfx的mRNA和蛋白表達表達均高于其在正常腦組織中的表達，在不同病理分級的腦膠質瘤中Zfx的表達水平有差異，Zfx的表達水平隨腦膠質瘤的惡性程度增高而增高。
　　 結論:Zfx的mRNA和蛋白表達在人腦膠質瘤中異常增高，與人腦膠質瘤的惡性程度呈正

3、相關，它有可能是腦膠質瘤抗凋亡、惡性增殖的一個關鍵性的調控因子。
　　 第二部分鋅指蛋白Zfx在人腦腫瘤干細胞中的表達與意義
　　 目的:X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細胞和成體干細胞自我更新的共同分子基礎，Zfx在人腦腫瘤干細胞(BTSCs)中的表達有待探討。
　　 方法:從人腦膠質瘤細胞系U251和U87中分選和鑒定腦腫瘤干細胞，通過免疫蛋白印跡法對樣本中Zfx的表達進行檢

4、測，應用統(tǒng)計學方法對人腦腫瘤干細胞中Zfx的表達進行分析。
　　 結果:CD133 陽性細胞在人腦膠質瘤中所占比例極其微?。篣251 約1.97％±0.53％，U87 約1.32％±0.34％。CD133 陽性細胞在無血清培養(yǎng)基中可以形成腫瘤球，且神經(jīng)干細胞標志物nestin 染色陽性；未分化腫瘤球在完全培養(yǎng)基中分化為腫瘤細胞，并表達與來源膠質瘤細胞相似的神經(jīng)元標志物β-tubulin和星形細胞標志物神經(jīng)膠質原纖維酸性蛋白（GF

5、AP）。未分化腫瘤球中Zfx的蛋白表達水平明顯高于其在分化腫瘤球和來源膠質瘤細胞中的表達。
　　 結論:Zfx的蛋白表達在人腦腫瘤干細胞中異常增高，它有可能是腦腫瘤干細胞自我更新、抗凋亡的一個關鍵性的調控因子。
　　 第三部分 Zfx基因慢病毒RNA干擾載體構建及有效靶點篩選
　　 目的：構建人Zfx基因慢病毒RNA 干擾載體，篩選干擾效率最高的有效靶點。
　　 方法：根據(jù)Zfx基因（NM_003410）

6、序列，利用軟件設計合成Zfx基因的特異性短發(fā)夾環(huán)（shRNA）干擾片段，將干擾片段構建到pFU-GW-iRNA 慢病毒載體中，獲得Zfx的慢病毒RNA 干擾載體。將慢病毒RNA 干擾載體轉染到人膠質瘤細胞系U251中，轉染7天后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白（GFP）表達，實時定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測干擾效率。
　　 結果：病毒轉染效率由熒光顯微鏡下GFP 陽性表達細胞在細胞總數(shù)中所占比例表示。轉染7天后熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)m

7、ock和 Zfx-RNAi組的病毒轉染效率均大于90％。干擾效率則由實時定量PCR和免疫蛋白印跡法檢測，實時定量PCR結果顯示轉染7天后Zfx-RNAi 各組中R2組的干擾效率最高，免疫蛋白印跡法證實轉染14天后R2組中Zfx 蛋白表達明顯低于control和mock組。
　　 結論：成功構建人Zfx基因慢病毒RNA 干擾載體并篩選出干擾效率最高的有效靶點，為進一步研究Zfx在人腦膠質瘤中的作用提供可靠的實驗平臺和研究基礎。

8、r>　　 第四部分鋅指蛋白Zfx在腦腫瘤干細胞自我更新和抗凋亡機制研究
　　 目的：X 染色體耦聯(lián)鋅指蛋白（Zfx）是鋅指蛋白超家族中的一員，是胚胎干細胞和成體干細胞自我更新的共同分子基礎，Zfx在人腦膠質瘤腫瘤干細胞中作用機制有待探討。
　　 方法：在膠質瘤細胞系U251和U87中通過慢病毒RNA 干擾介導Zfx沉默，免疫磁珠法分選和鑒定腦腫瘤干細胞，通過克隆形成、凋亡流式檢測和免疫蛋白印跡等方法探索Zfx在人腦膠質