低頻超聲與小劑量緩激肽聯(lián)合應用開放血腫瘤屏障機制的研究.pdf

1、血腦屏障(blood—brain barrier，BBB)是維持腦內(nèi)物質(zhì)轉(zhuǎn)運平衡的重要結(jié)構(gòu)，嚴格限制大分子物質(zhì)與98％的小分子物質(zhì)進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)。與BBB結(jié)構(gòu)類似，腦膠質(zhì)瘤細胞與微血管之間存在著血腫瘤屏障(blood-Tumor barrier，BTB)，是位于內(nèi)皮細胞之間由一些復雜的緊密連接(tight junction，TJ)蛋白系統(tǒng)構(gòu)成的限制親水性物質(zhì)跨過的細胞旁屏障。TJ蛋白系統(tǒng)是由claudins、occludin和ZO—1

2、等多種TJ相關(guān)蛋白構(gòu)成的復雜連接。BTB的通透性略高于正常的BBB，但仍具有屏障的功能。BTB的存在是限制抗腫瘤藥物療效的關(guān)鍵。研究者們已經(jīng)嘗試采取多種方法提高藥物通過BTB的通透性，如使用高滲性藥物甘露醇、設計能跨過屏障的藥物或載體、直接將藥物注射入腦、用導管經(jīng)動脈分支給藥、經(jīng)鼻腔給藥等，但是這些方法因受使用劑量大、有一定創(chuàng)傷性、安全性低、開放時間短等諸多條件的限制而難以得到臨床應用。 低頻超聲(low—frequency u

3、ltrasound，LFU)是臨床診斷中的常規(guī)手段之一。由于LFU具有在組織中易穿透，聲能吸收少，對組織損傷小的特點，近年來，國內(nèi)外學者也開始將LFU用于實驗性治療的研究中。LFU已經(jīng)應用于骨關(guān)節(jié)病及感染和炎癥的治療、促進骨折愈合、溶栓、軟組織修復及抗腫瘤細胞治療等實驗性治療研究。最近，國外研究發(fā)現(xiàn)，LFU作用于腦組織可以引起B(yǎng)BB的開放，采用的超聲頻率范圍為260 kHz～1.63 MHz，也有選用最大頻率為3.5 MHz的報道。研究

4、顯示，LFU也可以提高藥物在腦內(nèi)的通透性，但目前仍處于實驗階段，超聲條件還沒有統(tǒng)一的參數(shù)標準。我們的前期研究工作表明，在1 MHz、12 mW、聲壓0.48 Mpa和作用時間為20 s的條件下進行LFU輻照能夠可逆性開放BBB的同時，對正常神經(jīng)元沒有產(chǎn)生明顯損傷?？紤]到腫瘤術(shù)后骨窗，便于超聲輻照，上述研究提示LFU有可能成為研究可逆性開放BTB的新方法。目前關(guān)于LFU開放BBB或BTB的機制尚不清楚。 有報道灌注小劑量緩激肽(b

5、radykinin，BK)可能通過與膠質(zhì)瘤細胞上的B2受體結(jié)合，選擇性開放BTB，增加抗腫瘤藥物卡鉑到達腦腫瘤組織，有效延長腦惡性膠質(zhì)瘤的生存期。但是，研究發(fā)現(xiàn)，BK還有一些缺點，如劑量較大時有明顯的降血壓作用，并且由于BK可被快速降解，使得其增加BTB通透性的時間很短暫，因而臨床應用受限。因此，探尋提高緩激肽作用效果和時間的方法是目前的研究方向。 本研究嘗試單獨應用LFU輻照，或者LFU和小劑量BK聯(lián)合應用的方法，研究對BTB

6、通透性的影響，以及開放BTB細胞旁途徑的機制；同時研究二者單獨應用和聯(lián)合應用時，三種BTB的TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA和蛋白表達的變化，探討其可能的機制，并力圖尋求安全、較長效地開放BTB的二者聯(lián)合應用的劑量。 方法： 1、建立有超聲透聲窗的大鼠BTB模型。 2、應用伊文氏蘭(Evans blue，EB)滲透法檢測LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠BTB滲透性的變

7、化。 3、應用透射電鏡技術(shù)觀察LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細胞間TJ及腦膠質(zhì)瘤等超微結(jié)構(gòu)的改變。 4、應用RT-PCR法檢測LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達的變化。 5、應用免疫組織化學法檢測LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的分布和表達的變化。

8、 6、應用免疫熒光法檢測LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的分布和表達的變化。 7、應用western blot法檢測LFU與BK單獨或聯(lián)合應用前后腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1蛋白表達的變化。 結(jié)果： 1、 LFU輻照后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠的BTB通透性增加，在1.5 h達到峰值，12 h恢復正常水平。

9、 2、 LFU輻照引起C6腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ開放；對神經(jīng)元無明顯損傷，同時誘導C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡。 3、 LFU輻照后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達顯著減少；其減少的趨勢為在1.5 h時達最低值，12 h以后逐漸恢復正常。 4、LFU輻照后，C6腦膠質(zhì)瘤大鼠腦組織中微血管內(nèi)皮細胞上的TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和2O—1的表達減少；其減少的趨勢為在1.

10、5 h時達最低值，12 h以后逐漸恢復正常。 5、LFU與BK單獨應用后，BTB的通透性顯著增加；二者聯(lián)合應用后，BTB通透性進一步增加。 6、 LFU與BK單獨與聯(lián)合應用后，透射電鏡均可顯示C6腦膠質(zhì)瘤大鼠TJ開放。 7、 LFU與BK單獨應用后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表達顯著減少；二者聯(lián)合應用后TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的mRNA表

11、達進一步顯著減少。 8、 LFU與BK單獨應用后，TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的蛋白表達顯著減少；二者聯(lián)合應用后TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1的蛋白表達進一步顯著減少。 結(jié)論： 1、超聲參數(shù)為頻率1 MHz、強度12 mW、聲壓0.48 Mpa和作用時間20s的LFU是可逆性地開放BTB的適宜條件。 2、LFU在顯著地增加BTB的通透性的同時，能

12、可逆性地開放BTB的TJ；LFU在開放BTB的條件下對神經(jīng)元無明顯損傷，能夠誘導C6膠質(zhì)瘤細胞凋亡。 3、LFU輻照能使TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和ZO—1在mRNA和蛋白水平的表達顯著減少，此作用與LFU誘導TJ開放相關(guān)。 4、LFU與BK聯(lián)合應用能以協(xié)同作用的方式顯著增加BTB的通透性。 5、LFU與BK聯(lián)合應用能以協(xié)同作用的方式顯著減少TJ相關(guān)蛋白claudin—5、occludin和