膠原蛋白支架復合自體BMSCs修復關節(jié)軟骨缺損動物實驗研究.pdf

1、關節(jié)軟骨缺損在醫(yī)學臨床上越來受到關注，其中就診人員多以運動員、體力勞動者為主，普通人患病的幾率也呈現(xiàn)逐年增加趨勢[1-3]。除外傷病因外，手術切除（如腫瘤）、感染、痛風及退變等也引起關節(jié)軟骨缺損，常表現(xiàn)為頑固性疼痛、關節(jié)活動障礙，嚴重者可喪失關節(jié)功能，已成為導致肢體殘廢和勞動能力喪失的主要原因之一，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。由于軟骨組織內(nèi)沒有血管供應、神經(jīng)支配和淋巴回流，加之細胞成份單一，其自身修復能力非常有限，一旦損傷難于完全再生修復，

2、有報道顯示，直徑<3mm的軟骨缺損有可能部分或全部修復，直徑>4mm則不能自行修復[3]。針對軟骨缺損的治療，主要出于兩個目的：首先是要緩解關節(jié)疼痛和恢復關節(jié)功能；其次是阻止或至少延緩關節(jié)炎的進展[4]。臨床治療關節(jié)軟骨缺損的主要方法尚存在明顯不足[5]，例如，關節(jié)鏡下關節(jié)腔清術理只能暫時緩解疼痛癥狀，不能阻止病程發(fā)展；關節(jié)融合術將使關節(jié)功能喪失；人工關節(jié)置換術費用昂貴，且翻修率較高；骨軟骨塊移植術雖然取得較好療效，但自體骨軟骨移植，拆

3、東墻補西墻，將認為造成供區(qū)組織損傷；異體移植存在免疫排斥反應和潛在疾病傳染等風險。
　　組織工程技術的快速發(fā)展，為關節(jié)軟骨缺損的治療提供了新思路[6]，但目前該技術仍然處于研究階段[7-10]。1984年瑞典醫(yī)學家Peterson[11]等首次報道在兔關節(jié)軟骨缺損模型中，用可吸收縫合線將自體骨膜縫合于軟骨缺損周緣，然后將自體軟骨細胞懸液注入缺損中，術后16周檢測證實關節(jié)軟骨缺損被透明軟骨修復，并將此方法稱為自體軟骨細胞移植技術（A

4、utologous Chondrocyte Transplantation，ACT）。1987年瑞典歌德堡醫(yī)療中心Brittberg[4]等報道采用該技術成功治療人關節(jié)軟骨缺損，這為隨后深入開展的軟骨組織工程創(chuàng)造了有利條件。1995年美國Genzyme公司改良該技術用于制備較原始的軟骨組織工程產(chǎn)品，并注冊為Carticel?產(chǎn)品，1997年通過美國FDA批準后逐漸在臨床推廣應用，至2004年已有3952名患者受益于該技術。2000年瑞典

5、Sahlgrenska醫(yī)院Peterson[12]等報告了101例膝關節(jié)軟骨缺損的患者接受ACT技術的治療情況，其中94例經(jīng)過2～9年隨訪，臨床有效率達87.5％以上；但同時發(fā)現(xiàn)存在骨膜剝脫、細胞逸散及骨膜肥大等并發(fā)癥。后來Haddo等用一種Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架支架（Chondro-GideTM,Geistlich Biomaterials，Swiss）代替骨膜進行對照研究，Chondro-GideTM這種產(chǎn)品提取于動物皮膚膠原中，具有

6、較好的生物組織相容性、低免疫原性，其內(nèi)部分為兩層（光滑面和粗糙面），光滑面為細胞生長提供了穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)，粗糙面可以有效的使細胞攀附，通過1年的隨訪證實方法具有良好的臨床療效，無骨膜肥大、剝脫等并發(fā)癥，同時此方法避免了因獲取骨膜而增加的額外創(chuàng)傷，該技術被視為第二代ACT技術（又稱為ACT-C），但是這種技術仍需要一次或多次手術取軟骨細胞體外培養(yǎng)[13-16]。隨著組織工程技術的發(fā)展，Verigen澳大利亞公司研發(fā)了MACI（matrix-i

7、nduced autologous chondrocyte implantation）技術，即第三代ACT技術用于治療多種原因引起的關節(jié)軟骨缺損。該技術的基本過程為，在關節(jié)鏡下采集患者關節(jié)非負重區(qū)少量軟骨（約黃豆大?。┤缓筮M行軟骨細胞分離、培養(yǎng)及增殖，最后將軟骨細胞種植在MACI?生物膜（Ⅰ/Ⅲ膠原膜）上構建組織工程軟骨，移植到患者關節(jié)軟骨缺損區(qū)。該技術取得較好療效同時克服了第一、二代ACT技術的缺點，研究目前尚處在探索階段。目前MAC

8、I技術存在不足的是，需要二次或二次以上手術，其中包括一次或多次手術取材（軟骨細胞）[17,18]，而且前期培養(yǎng)細胞的費用昂貴，僅培養(yǎng)軟骨細胞一項就大約需要7000歐元，這無疑制約了其發(fā)展。
　　我國對組織工程軟骨的研究在總體上滯后于國外先進水平，雖然在某些方面還是取得了令世人矚目成果，如1997年曹誼林等報道在裸鼠背上成功長出具有人耳輪廓形狀的組織工程軟骨，但國目前尚無自主研發(fā)的組織工程軟骨應用于臨床治療，同時也缺乏相應的行業(yè)應用

9、標準，從而嚴重限制了軟骨組織工程的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院關節(jié)外科中心自1997年開始對組織工程軟骨進行研究與開發(fā)，并于國際上率先提出組織工程軟骨仿生構建新理念，結構仿生、成分仿生及功能仿生是該理念的精神。依據(jù)該理念，本研究選用關節(jié)軟骨細胞外基質(zhì)主要成分--Ⅱ型膠原蛋白為組織工程軟骨支架材料。根據(jù)臨床應用微骨折技術治療軟骨缺損的原理，通過鉆孔使骨髓內(nèi)間充質(zhì)干細胞（Bone Marrow Mesenchymal stem cell

10、s，BMSCs）流至軟骨缺損區(qū)，利用局部微環(huán)境分化成軟骨細胞進而修復軟骨缺損，本研究選用自體BMSCs為組織工程軟骨的種子細胞，并通過大動物（山羊）實驗研究，驗證該策略的修復效果。
　　本研究在前期建立Ⅱ型膠原蛋白分離、純化的基礎上，繼續(xù)探索以Ⅱ型膠原蛋白為主要成分的組織工程軟骨支架材料制備技術；建立自體BMSCs分離、純化及擴增技術；最后以國外Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架為對照，通過動物實驗研究探討Ⅱ型膠原蛋白支架復合自體BMSCs治療

11、軟骨缺損的再生修復效果。
　　研究方法:
　　1．本實驗以青山羊為實驗動物，在前期相關研究的基礎上，進一步優(yōu)化BMSCs分離、純化技術，重點研究自體血清的分離、純化技術及采用自體血清培養(yǎng)BMSCs技術，以不同濃度自體血清作為培養(yǎng)基，細胞經(jīng)流式細胞儀檢測生長周期及定向分化誘導做MSCs細胞鑒定。
　　2．對Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架的超微結構進行分析；以青山羊為實驗動物建立膝關節(jié)軟骨缺損模型，15只12月齡山羊，隨機分為3組，

12、每組10例膝關節(jié)，A組為空白對照組，B組為單純Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架組，C組為Ⅰ/Ⅲ型膠原雙層支架復合MSCs移植術組，按實驗分組進行處理；術后6周、24周取材，分別進行大體觀察、組織學評分對各分組修復效果進行評價。
　　3．從豬膝關節(jié)軟骨分離、純化Ⅱ型膠原，之后由低溫冷凍真空干燥制備成支架，對支架進行體內(nèi)、體外生物相容性測試，掃描電鏡、組織學觀察支架結構。實驗動物5只山羊，觀察Ⅱ膠原支架復合細胞治療軟骨缺損研究，術后24周取材，評

13、價Ⅱ型膠原蛋白復合自體BMSCs治療軟骨缺損的再生修復效果。
　　研究結果:
　　1．本部分研究建立了自體血清制備技術和BMSCs分離、純化及擴增技術。80ml山羊全血可獲取38.2±0.6ml血清，約占全血的50％。8ml骨髓可以分離出2×106個BMSCs，采用10％自體血清培養(yǎng)7天細胞數(shù)量增加6倍，與胎牛血清培養(yǎng)組無顯著差異；第2代細胞周期比例為：G1期79.32％，G2期12.12％，S期8.56％，說明BMSCs具

14、有較強的增殖能力；成骨和成軟骨誘導實驗表明采用自體血清培養(yǎng)的BMSCs具有多向分化潛能。
　　2．成功建立山羊膝關節(jié)軟骨缺損模型和Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架復合自體BMSCs植入技術。術后24周MRI示關節(jié)腔無積液、滑膜無增生，實驗組修復組織與正常軟骨信號無區(qū)別；大體觀察修復組織與正常軟骨持平，顏色與與正常軟骨相似。組織學證實修復組織為透明軟骨。Wakitani評分實驗組為2.55±1.02，明顯好于單純支架組（7.06±1.13）和空

15、白對照組（10.25±1.38）?？瞻讓φ战M和單純支架組修復效果較差。
　　3．成功建立以Ⅱ型膠原蛋白為材料的組織工程軟骨支架制備技術，采用該技術制備的Ⅱ型膠原支架孔徑約40-130μm，孔隙率約90％以上并且孔通率較好，細胞材料共培養(yǎng)實驗和兔背部皮下植入實驗證實Ⅱ型膠原支架具有良好的細胞相容性和組織相容性。建立了Ⅱ型膠原蛋白復合BMSCs體外構建及培養(yǎng)技術以及體內(nèi)植入技術。術后24周大體觀察，大體觀察修復組織顏色與正常軟骨相似，

16、與正常軟骨整合良好。組織學證實為透明軟骨。Wakitani評分為1.86±0.28，明顯好于Ⅰ/Ⅲ型膠原支架復合細胞組（2.55±1.02）和空白對照組（11.42±1.26）。
　　研究結論:
　　1．建立了自體血清制備技術，80ml羊全血可獲取38.2±0.6ml血清，約占全血的50％。
　　2．建立了BMSCs分離、純化及自體血清培養(yǎng)技術。8ml骨髓可以分離出2×106個BMSCs，采用10％自體血清培養(yǎng)7天細胞

17、數(shù)量增加6倍，與胎牛血清培養(yǎng)組無顯著差異；且培養(yǎng)擴增的BMSCs具有較強的增殖能力和多向分化潛能。
　　3．建立羊麻醉和復蘇技術，為以羊為實驗動物提供了技術方法。建立了膝關節(jié)全厚軟骨缺損模型，為組織工程軟骨動物實驗研究提供了良好的評價平臺。
　　4．建立了以Ⅱ型膠原蛋白為材料組織工程軟骨支架制備技術，采用該技術制備的Ⅱ型膠原支架孔徑約40-130μm，孔隙率約90％以上并且孔通率較好，細胞材料共培養(yǎng)實驗和兔背部皮下植入實驗證

18、實Ⅱ型膠原支架具有良好細胞相容性和組織相容性。
　　5．以Ⅰ/Ⅲ型雙層膠原支架復合自體BMSCs植入技術加軟骨下骨微骨折技術可以修復直徑為6mm全層軟骨缺損。術后24周關節(jié)腔無積液、滑膜無增生，組織學證實修復組織為混合樣軟骨。
　　6．將BMSCs接種于Ⅱ型膠原蛋白支架體外培養(yǎng)5天，植入體內(nèi)可修復直徑為6mm全層軟骨缺損，修復結果為透明樣軟骨，Wakitani評分為1.86±0.28，明顯好于Ⅰ/Ⅲ型膠原支架復合細胞組（2.