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文檔簡介
1、第一部分
免疫復合物對人血管內皮細胞的活化作用及其機制研究
背景:
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以免疫復合物(immune complexes,ICs)形成為特征的慢性自身免疫性疾病,其中有文獻報道免疫復合物包括核酸,核酸相關蛋白和相應的自身抗體三種成分。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血中,自然凋亡的細胞不能被單核巨噬細胞清除,結果導致了這些
2、凋亡細胞的二次凋亡壞死,自身抗原成分核酸和核酸相關蛋白就從這些二次凋亡細胞的細胞核中釋放出來,然后便產生了針對這些核自身抗原成分的相應的自身抗體,例如抗雙鏈DNA抗體,導致了免疫復合物的形成。免疫復合物沉積在患者的靶器官如皮膚和腎臟中,導致了這些器官的炎癥和損傷。
血管病變和血管炎,是系統(tǒng)性紅斑狼瘡的典型的并發(fā)癥,有報道稱其發(fā)生在10%至40%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者,多見于患者的皮膚血管,腎小球,冠狀動脈和腦血管。有文獻報道
3、系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管病變和血管炎與免疫復合物沉積,內皮細胞活化以及炎癥細胞的浸潤有關。然而,免疫復合物對血管內皮細胞的作用及其機制尚不明確。
高遷移率族蛋白1(high-mobility group box1 protein,HMGB1),也叫做兩性霉素,屬于核酸相關蛋白,是免疫復合物中的一種重要成分。它幾乎在所有的真核細胞中表達,主要位于細胞核中,在細胞核中,它與核酸成分結合穩(wěn)定核小體的結構,并且誘導DNA彎曲來調節(jié)轉錄。
4、在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,HMGB1-核酸復合物從二次凋亡的細胞核中釋放出來,與相應的自身抗體形成免疫復合物,在血漿中被檢測到顯著升高。在靶器官例如皮膚和腎臟中,包含HMGB1的免疫復合物大量沉積,導致了靶器官的慢性炎癥和組織損傷。HMGB1的促炎癥活性主要由其受體晚期糖基化終末產物受體(the receptor for advanced glycationend products,RAGE)來介導。RAGE是一種跨膜蛋白,是免疫球蛋白超
5、家族的成員,在HMGB1介導的信號通路中,它是一個主要的信號轉導受體。RAGE主要在血管內皮細胞,單核和巨噬細胞的細胞膜上表達,能夠經過經典的信號激活途徑來激活轉錄因子NF-λB家族成員p65,而且可以通過激活p65來調節(jié)自身的表達。
了解了HMGB1是免疫復合物的重要成分,并且HMGB1的促炎癥活性主要由其受體RAGE來承載。那么,HMGB1-RAGE細胞信號途徑有可能在免疫復合物對內皮細胞的作用中發(fā)揮重要的作用。然而目
6、前為止,這一作用尚沒有文獻報道。因而,評價HMGB1-RAGE細胞信號通路在免疫復合物對內皮細胞的作用中發(fā)揮的作用來探討HMGB1-RAGE細胞信號通路是不是免疫復合物對內皮細胞的作用中的一種可能的機制將會很有意義和價值。
HMGB1的作用能被HMGB1 A-box特異性的阻斷,RAGE能被可溶性RAGE(soluble RAGE,sRAGE)阻斷。HMGB1 A-box,sRAGE,Bay117082以及這些阻斷劑的組合
7、分別被用來阻斷HMGB1-RAGE細胞信號途徑上的免疫復合物中HMGB成分,內皮細胞表面的RAGE受體,內皮細胞的轉錄因子NF-κB p65以及它們的組合來檢測免疫復合物對內皮細胞作用的發(fā)生是不是通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑。有報道稱p38細胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)和細胞外信號相關激酶1/2(extracellular signal-related ki
8、nases1 and2,ERK1/2)信號途徑位于RAGE介導的轉錄因子NF-κB活化的通路上,在本研究中,p38 MAPK和ERK1/2的特異性阻斷劑SB203580和PD98059分別用來阻斷p38 MAPK和ERK1/2,以評價這兩個細胞信號途徑在免疫復合物誘導的血管內皮細胞細胞因子分泌反應中所發(fā)揮的作用。
目的:
探索免疫復合物對人血管內皮細胞的作用,評價HMGB1-RAGE細胞信號通路在免疫復合物對
9、人血管內皮細胞活化中所發(fā)揮的作用,來探討人系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎中免疫復合物對血管內皮細胞的活化作用及其其中一種可能的機制。
方法:
1.在免疫復合物刺激和阻斷劑阻斷實驗中,把人臍靜脈內皮細胞株CRL-1730細胞接種到直徑為6 cm的細胞培養(yǎng)皿中,在細胞達到80%單層細胞融合的時候,對細胞分組并且加藥干預。先分別加入阻斷劑HMGB1 A-box(10μg/ml),sRAGE(20μg/ml),SB203580
10、(10μM),PD98059(25μM),Bay117082(1μM)或者它們的組合干預1小時,然后加入免疫復合物。孵育2小時后,NF-κB家族成員p65在細胞核中的水平的變化分別用免疫熒光,免疫組化和Western Blot的方法來檢測。孵育6小時后,基因RAGE,ICAM-1,VCAM-1,IL-8,MCP-1,IL-6,TNF-α和IL-1β mRNA水平的變化用熒光實時定量PCR的方法來檢測。孵育16小時后,細胞表面蛋白RAGE
11、,ICAM-1,VCAM-1表達水平的變化用免疫熒光,免疫組化,流式以及細胞ELISA的方法來檢測分析。孵育24小時后,細胞上清液中細胞因子IL-8,MCP-1,IL-6,TNF-α和IL-1β濃度的變化用ELISA的方法來檢測。
2.在單核細胞跨血管內皮細胞遷移的實驗中,先把人臍靜脈內皮細胞株CRL-1730細胞接種在明膠包被的具有通透性的Transwell小室的濾膜上,形成一單血管內皮細胞層后,對該層血管內皮細胞分組并
12、且用方法1中描述的方法用阻斷劑和免疫復合物進行干預24小時。然后將單核細胞加入到上室中進行跨血管內皮細胞遷移,20小時后,將遷移至下室的單核細胞收集起來用細胞計數儀計數,并且比較不同干預組之間單核細胞跨內皮細胞遷移的差異。
3.在細胞活性測定實驗中,把人臍靜脈內皮細胞株CRL-1730以每孔105個細胞的密度接種到24孔板中,孵育過夜至細胞貼壁融合。將細胞分組,然后分別加入HMGB1 A-box(10μg/ml), sRA
13、GE(20μg/ml), SB203580(10μM), PD98059(25μM),Bay117082(1μM)或者它們的組合進行干預。24小時后,將細胞收集起來,用細胞計數儀計數不同干預組細胞總數的變化,用臺盼藍染色的方法計數活細胞數目的差異,并且用CCK-8的方法檢測細胞活性的差異。
4.實驗中,用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數據用均數±標準誤來表示。不同實驗組之間的差異用單因素方差分析進行分析,兩組數
14、據之間的比較用t檢驗進行分析,P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路上調人血管內皮細胞表面RAGE受體的表達。
2.免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路上調人血管內皮細胞表面粘附分子ICAM-1和VCAM-1的表達。
3.免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑增加了人血管內皮細胞趨化因子IL-8,MCP-1
15、和促炎癥細胞因子IL-6,TNF-α的分泌。
4.p38 MAPK和ERK1/2信號途徑在免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑誘導人血管內皮細胞活化中發(fā)揮重要作用。
5.免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號途徑導致了人血管內皮細胞中轉錄因子NF-κB p65的活化。
6.免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路增強了單核細胞的跨血管內皮細胞遷移。
7.HMGB
16、1-RAGE細胞信號途徑上的阻斷劑HMGB1-A-box,sRAGE,Bay117082,SB203580,PD98059以及它們的組合本身對人血管內皮細胞沒有細胞毒性作用。
結論:
本研究證明免疫復合物通過HMGB1-RAGE細胞信號通路引發(fā)了人血管內皮細胞的促炎癥反應,而且導致了血管內皮細胞功能的變化。這為免疫復合物對人血管內皮細胞的活化作用及其其中一種潛在的機制提供了證明,在理解系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎的發(fā)
17、病機制中發(fā)揮重要的作用,并且為將來系統(tǒng)性紅斑狼瘡血管炎的治療提供了有力的證據。
第二部分
免疫復合物對人單核細胞的活化作用及其機制和治療方法研究
背景:
系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是一種以免疫復合物(immune complexes,ICs)形成為特征的慢性自身免疫性疾病,其中有文獻報道免疫復合物包括核酸,核酸相關蛋白和相應的
18、自身抗體三種成分。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,自然凋亡的細胞不能被單核巨噬細胞清除,結果導致了這些凋亡細胞的二次凋亡壞死,自身抗原成分核酸和核酸相關蛋白就從這些二次凋亡細胞的細胞核中釋放出來。然后,針對這些核自身抗原成分的相應的自身抗體,例如抗雙鏈DNA抗體便產生了,導致了免疫復合物的形成。免疫復合物沉積在人體的靶器官如皮膚和腎臟中,導致了這些器官的炎癥和損傷。
有文獻報道系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的單核細胞異?;罨?,并且通過產生一系
19、列的細胞因子和功能異常來啟動和維持自身免疫反應。其中,IL-6,TNF-α和MCP-1是由單核細胞產生的,在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的單核細胞中異常地表達升高,并且在系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病過程中發(fā)揮了重要作用的細胞因子。單核細胞是人外周血中IL-6的主要來源,IL-6在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中促進B細胞分化成為產生自身抗體的漿細胞,并且促進自身抗體的產生。TNF-α是一個重要的促炎癥因子,它的過表達導致了炎癥的持續(xù)。MCP-1是一種作用非常強的單核細胞
20、趨化蛋白,它促使單核細胞聚集在炎癥發(fā)生的部位。最近對狼瘡腎炎的研究表明,異?;罨膯魏司奘杉毎诶钳從I炎中大量浸潤,促進了狼瘡腎炎的炎癥和損傷,并且影響狼瘡腎炎的最終結果。
包含核酸,核酸相關蛋白和相應自身抗體三種成分的免疫復合物是具有致病性的。有文獻報道,從系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者提取的免疫復合物中的核酸成分與從凋亡細胞中釋放的染色質片段的大小差不多,這些片段含有豐富的寡聚核苷酸A類CpG,可以特異性的被表達于單核細胞,類漿細
21、胞樣樹突狀細胞和B細胞上的模式識別受體TLR9識別。TLR9的活化可以被其拮抗劑抑制性的寡聚脫氧核苷酸ODN2088特異性的阻斷。HMGB1,高遷移率族蛋白1,也叫做兩性霉素,屬于免疫復合物中的核酸相關蛋白成分,是免疫復合物中另外一個重要的成分。它表達于幾乎所有的有核細胞,并且主要位于細胞的細胞核中。在細胞核中,它與核苷酸結合來穩(wěn)定核小體的結構,并且誘導DNA彎曲來調節(jié)轉錄。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中,HMGB1從二次凋亡的細胞核中釋放出來
22、,并且在血漿中被檢測到顯著升高。一旦釋放到細胞外的環(huán)境中,HMGB1就作為一種炎癥刺激因子,刺激炎癥細胞進一步產生更多的細胞因子。HMGB1的促炎癥作用主要通過與其細胞表面受體RAGE來發(fā)生。RAGE是第一個確定的HMGB1的受體,主要表達在單核細胞,血管平滑肌細胞,內皮細胞等細胞的表面,可被可溶性RAGE阻斷。有文獻報道免疫復合物能活化類漿細胞樣樹突狀細胞和自身反應性B細胞來誘導IFN-α和其它促炎癥因子的產生,促進疾病的發(fā)展,通過免
23、疫復合物中的核酸和HMGB1成分活化細胞受體TLR9和RAGE。然而,免疫復合物對單核細胞的作用及其潛在的機制尚不明確。
細胞表面受體RAGE和細胞漿受體TLR9都能夠通過經典的活化途徑活化NF-κB家族成員p65,p65能調節(jié)IL-6,TNF-α和MCP-1的表達。另外,RAGE受體被激活后,通過信號通路活化NF-κB家族成員p65,p65還能調節(jié)RAGE自身的表達。在本研究中,免疫復合物被用來檢測其對單核細胞的作用,可
24、溶性RAGE,ODN2088和Bay117082被用來分別阻斷RAGE受體,TLR9和NF-κB p65來檢測免疫復合物對單核細胞作用的可能的機制。
雖然近來在抗炎癥治療方面有所進展,但是當前對系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療的選擇還存在很多分歧和不確定。前面已有研究報道過氧化物酶體增值物受體γ(PPAR-γ)激動劑在系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠模型中是一種很有效的治療方法。它能夠減少自身抗體的產生,而且能夠減少腎臟炎癥和損傷。研究報道,PPAR
25、-γ激動劑包括噻唑烷二酮類(thiazolidinediones,TZDs),前列腺素類和非甾體類抗炎藥物(NSAIDs)三種,激活了表達于單核細胞,角質化細胞等細胞核內的核受體PPAR-γ以后,通過與轉錄因子NF-κB的相互作用來調節(jié)促炎癥因子的表達。也有文獻報道,PPAR-γ激動劑通過抑制NF-κB p65的核轉移和通過形成PPAR-γ-p65復合物,來減少NF-κB p65與其靶核苷酸調節(jié)序列的結合。在本研究中,我們選擇噻唑烷二酮
26、類藥物匹格列酮(pioglitazone),它是PPAR-γ受體的一種藥理性激動劑,作為PPAR-γ激動劑的代表,在體外實驗檢測PPAR-γ激動劑對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異?;罨淖饔眉捌錂C制,在前面報道的對狼瘡鼠的有效的治療作用的基礎上,進一步探測它的對系統(tǒng)性紅斑狼瘡的治療作用。
目的:
在本研究中,我們探索免疫復合物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核細胞異?;罨鸬淖饔眉捌錆撛诘臋C制,并且為系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者單核
27、細胞異?;罨岢鲆环N可能的治療方法。
方法:
1.把人單核細胞白血病細胞株U937以每孔106個細胞的密度接種到6孔板中,將細胞分組,分別與sRAGE(20μg/ml),ODN2088(12μg/ml),Bay117082(1μM)或者PPAR-γ激動劑匹格列酮(10μM)孵育1小時,然后加入免疫復合物。孵育2小時后,用Western Blot的方法來檢測NF-κB家族成員p65在細胞核中水平的變化,用免疫沉
28、淀的方法檢測PPAR-γ-p65復合物的形成。孵育6小時后,用熒光實時定量RT-PCR的方法來檢測基因RAGE,IL-6,TNF-α和MCP-1 mRNA水平的變化。孵育16小時后,用流式和Western Blot的方法來檢測RAGE蛋白表達的變化。孵育24小時后,用ELISA的方法來檢測細胞上清液中細胞因子IL-6,TNF-α和MCP-1的濃度的變化,用Transwell的方法來檢測單核細胞跨血管內皮細胞遷移的變化。
2
29、.在檢測細胞活性的實驗中,把人單核細胞白血病細胞株U937以每孔5×105個細胞的密度接種到12孔板中,將細胞分組,分別與sRAGE(20μg/ml),ODN2088(12μg/ml),Bay117082(1μM)或者PPAR-γ激動劑匹格列酮(10μM)孵育24小時。分別用細胞計數儀計數細胞總數,臺盼藍染色活細胞數以及CCK-8的方法來檢測細胞活性的變化。
3.實驗中,用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析,實驗數據用均
30、數±標準誤來表示。不同實驗組之間的差異用單因素方差分析進行分析,兩組數據之間的比較用t檢驗進行分析,P值<0.05被認為具有統(tǒng)計學意義。
結果:
1.免疫復合物通過TLR9介導的NF-κB的活化上調人單核細胞表面受體RAGE的表達,這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
2.免疫復合物通過RAGE/TLR9介導的NF-κB的活化增加人單核細胞細胞因子IL-6,MCP-1和TNF-α的分泌,這一作用
31、可能被PPAR-γ激動劑抑制。
3.免疫復合物通過RAGE/TLR9介導的NF-κ B的活化增強單核細胞跨血管內皮細胞遷移,這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
4.免疫復合物通過RAGE/TLR9介導的NF-κB的活化增加人單核細胞NF-κB家族成員p65的核轉移,這一作用可被PPAR-γ激動劑抑制。
5.PPAR-γ激動劑匹格列酮通過以劑量依賴的形式形成PPAR-γ-p65復合物抑制免疫復合
32、物誘導的人單核細胞NF-κB p65的活化。
6.實驗中用到的sRAGE,ODN2088,Bay117982和匹格列酮對單核細胞沒有細胞毒性。
結論:
本研究證實了免疫復合物對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異?;罨鸬淖饔貌⑶覍γ庖邚秃衔锶绾螌е聠魏思毎惓;罨峁┝艘环N可能的機制,這為系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病機制的研究提供了重要證據。另外,本研究對系統(tǒng)性紅斑狼瘡單核細胞異?;罨岢隽艘环N可能的治療方法,這
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