Livin mRNA反義寡核苷酸對(duì)人肝癌細(xì)胞株HepG-2體外增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的: 觀察結(jié)合于Livin mRNA的BIR結(jié)構(gòu)域上的反義寡核苷酸(antisense oligodexynucleotide,ASODN)對(duì)Livin基因的抑制效應(yīng),及對(duì)人類肝癌細(xì)胞株HepG-2體外增殖和凋亡的影響。期望觀察到理想的抑瘤效果,為針對(duì)Livin基因的反義治療策略及臨床抗腫瘤藥物開(kāi)發(fā)提供新的思路。
　　 方法:
　　 從genbank上查得livin mRNA的序列,并找出其中的BIR結(jié)構(gòu)域,基于最小自

2、由能原理算法分析出livin mRNA上的低結(jié)合自由能區(qū)域,并針對(duì)這一區(qū)域合成反義寡核苷酸ASODN及其對(duì)照組錯(cuò)義寡核苷酸(missense oligodexynucleotide,MSODN),其中反義鏈(Antisense strand)是與Livin mRNA的BIR結(jié)構(gòu)域20個(gè)堿基序列互補(bǔ)的反義寡核苷酸片段,錯(cuò)義鏈(Missensestrand)與Livin mRNA無(wú)配對(duì)關(guān)系,且不與任何人類已知基因互補(bǔ)。根據(jù)作用藥物不同,實(shí)驗(yàn)

3、可分為ASODN組(處理藥物為ASODN)、MSODN組(處理藥物為MSODN)和對(duì)照組(處理藥物為無(wú)抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)基)。上述藥物作用于人肝癌細(xì)胞株HepG-2,采用MTT法檢測(cè)Livin ASODN對(duì)HepG-2細(xì)胞的增殖抑制作用,倒置顯微鏡、透射電子顯微鏡、HE染色、瑞式-姬姆薩染色、流式細(xì)胞儀(FCM)以及吖啶橙/溴化乙錠(AO/EB)細(xì)胞染色法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變和細(xì)胞凋亡水平;AMV一步法RT-PCR檢測(cè)livin

4、mRNA水平；免疫細(xì)胞化學(xué)方法檢測(cè)livin蛋白表達(dá)水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.HepG-2細(xì)胞增殖受抑,且抑制效應(yīng)與寡核苷酸濃度、作用時(shí)間呈量效及時(shí)效關(guān)系。
　　 2. livin mRNA及蛋白表達(dá)水平下降,細(xì)胞出現(xiàn)凋亡。
　　 結(jié)論:
　　 1.ASODN能抑制livin基因的表達(dá),在體外能抑制肝癌細(xì)胞增殖。
　　 2.對(duì)于較短的mRNA,利用最小自由能原理對(duì)其設(shè)計(jì)反義核酸是一種