PYR激活通過SUMO化修飾上調P53抑制胰島β細胞增殖.pdf

1、目的：PKR(double-stranded RNA-dependent protein kinase)是雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，參與多種刺激因子介導的細胞周期阻滯和生長抑制。PKR的激活能通過抑制胰島β細胞增殖和阻滯細胞周期G1期參與2型糖尿病的發(fā)病過程。研究表明，細胞周期抑制蛋白P53的上調是PKR激活誘導胰島β細胞增殖抑制的重要信號分子，而其調控機制并不清楚。本研究旨在探討PKR通過SMUO化上調P53途徑誘導胰島β細胞周期阻滯

2、的調控機制。
　　方法：采用轉染wt-PKR質粒構建PKR過表達的MIN-6（小鼠）胰島β細胞系。使用低濃度BEPP(1μM)，糖脂毒性（16.7mM葡萄糖+0.1mM棕櫚酸）或前炎癥因子TNF-α(80nM)刺激MIN-6細胞，誘導PKR特異性激活。EdU熒光標記、Hoechst33258染色和流式細胞術分別評價胰島β細胞的增殖以及細胞周期進程的變化。免疫印跡檢測p-PKR和p-eIF-2α蛋白水平來分析PKR是否激活。免疫共沉

3、淀技術檢測PKR-Ubc9，P53-Ubc9及P53-SUMO-1蛋白結合水平繼而分析P53的SUMO化修飾，并采用免疫印跡檢測SUMO-1，Ubc9及P53蛋白表達，對P53進行蛋白半定量分析，且運用免疫熒光觀察PKR和Ubc9的細胞共定位。最后給予PKR抑制劑2-AP，神經酰胺合成酶抑制劑FUMO B1及SUMO化修飾抑制劑Spectomycin B1預處理MIN-6細胞，重復上述實驗，探討其相關分子機制。
　　結果：在PKR

4、過表達的MIN-6細胞中，低濃度BEPP、糖脂毒性及前炎癥因子TNF-α均能特異性激活PKR，使PKR和eIF-2α發(fā)生磷酸化。PKR的激活能夠抑制胰島β細胞增殖，并使其細胞周期阻滯于G1期。其周期阻滯的主要機制是激活的PKR與Ubc9相互結合，激活的Ubc9能作為SUMO E2連接酶誘導P53發(fā)生SUMO化修飾。同時發(fā)現PKR和Ubc9主要共定位于胞漿。Spectomycin B1能抑制P53的SUMO化修飾和蛋白水平上調。同樣，給予