胰腺癌吉西他濱耐藥基因的篩選及Emodin增強吉西他濱治療胰腺癌的研究.pdf

1、1．研究背景與目的： 胰腺癌(Pancreaticcancer)以早期發(fā)現(xiàn)困難，病情發(fā)展迅速為特征而成為預后極差的消化道惡性腫瘤之一。手術(shù)切除是唯一根治的手段。但是，多數(shù)患者就診時已屬晚期，只有10％～15％的患者有手術(shù)切除機會；手術(shù)切除的病人術(shù)后也多發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移，故此胰腺癌的預后極差，總體5年生存率低于5％，確診后平均生存時間不超過6個月?；熓且认侔┲匾妮o助治療手段，對于改善病人生存質(zhì)量，延長生存期有一定作用。目前，吉西

2、他濱是胰腺癌化療的一線藥物，但總體有效率低于20％。主要問題在于多數(shù)胰腺癌病人對吉西他濱產(chǎn)生耐藥。因此尋找胰腺癌吉西他濱耐藥基因和增加吉西他濱的療效是臨床急需要解決的問題。 Emodin是從自然植物中提取的一種活性物質(zhì)，具有抗炎，抗腫瘤及抗菌作用，同時，Emodin是酪氨酸激酶Ⅱ的抑制劑。 我們采用Affymetrix公司的HGU133A2.0芯片檢測未經(jīng)處理的胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株(Panc-1)和非耐藥細胞株(Bx

3、pc-3)基因表達譜的變化，篩選鑒定出胰腺癌吉西他濱耐藥基因，通過一系列實驗探討了Emodin增強吉西他濱對胰腺癌細胞株生物學行為的作用，并進一步分析Emodin增強吉西他濱治療胰腺癌的作用機制。 2．材料和方法： 2.1．采用Affymetrix公司的HGU133A2.0寡核苷酸基因芯片，檢測胰腺癌吉西他濱耐藥細胞株(Panc-1)和非耐藥細胞株(Bxpc-3)基因表達譜，篩選出胰腺癌吉西他濱耐藥基因．并利用熒光定量P

4、CR對選擇的芯片結(jié)果中差異表達的基因進一步驗證． 2.2．采用MTT試驗調(diào)查不同濃度Emodin和吉西他濱在不同時間對胰腺癌細胞活力的影響，初步確定下一步實驗濃度。MTT方法檢測Emodin和吉西他濱聯(lián)合作用48h對胰腺癌細胞活力的影響。 2.3．采用流式細胞術(shù)，caspase3酶活性試驗及檢測PARP的剪切來觀察Emodin和吉西他濱及聯(lián)合用藥對胰腺癌細胞凋亡的影響。 2.4．對數(shù)期生長的Bxpc-3細胞每只0

5、.1ml(7×106)接種于4-6周齡20g雄性BALB/Cnu/nu裸小鼠背部皮下，制成胰腺癌種植瘤模型，待腫瘤全部長出后隨機分為4組，分別給予生理鹽水，Emodin(40mg/kg)，吉西他濱(125mg/kg)，及兩藥聯(lián)合，每周二次腹腔注射，連續(xù)2周。每周測2次腫瘤大小及動物體重，研究Emodin在體內(nèi)增強吉西他濱治療胰腺癌作用。 2.5．分別采用缺口末端標記法(TUNEL)和免疫組織化學檢測Emodin在體內(nèi)增強吉西他濱

6、誘導胰腺癌細胞凋亡和抑制細胞增殖。 2.6．采用RT—PCR、qRT—PCR和Westernblot方法探討Emodin對選擇的胰腺癌吉西他濱耐藥基因的影響。分析Emodin增強吉西他濱治療胰腺癌的作用機制。 2.7．統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)表達為(x)±SE，進行雙側(cè)t檢驗或單因素方差分析(ANOVA，LSD多重比較)，P＜0.05視為具有統(tǒng)計學意義。統(tǒng)計由SPSS13.0統(tǒng)計包完成。 3．結(jié)果： 3.1鑒定胰

7、腺癌吉西他濱耐藥相關(guān)基因采用HGU133A2.0寡核苷酸基因芯片檢測兩細胞株基因表達譜，鑒定相互2887各表達有差異的基因。與非耐藥細胞株(Bxpc-3)比較，耐藥細胞株(Panc-1)5倍及5倍以上差異基因有141個。高表達基因和低表達基因分別有103個和38個。 3.2qRT—PCR驗證基因芯片結(jié)果為了驗證基因芯片結(jié)果，應用qRT—PCR檢測兩種細胞中22個耐藥細胞株(Panc-1)5倍以上過表達的基因。結(jié)果顯示21個基因兩

8、種方法所得基因表達倍數(shù)大致相當。 3.3Emodin在體外增加吉西他濱對胰腺癌細胞生長的抑制為了探討Emodin對胰腺癌細胞生長的影響，應用MTT方法檢測不同濃度的Emodin(0-160μM)作用于胰腺癌細胞24h、48h和72h的效應．結(jié)果顯示隨著Emodin濃度和作用時間的增加，細胞活力呈下降趨勢。隨后的實驗揭示，和單用藥比較，給予48小時Emodin(Bxpc-3和MiaPaca-2,40μM；Panc-1，80μM)在

9、體外可顯著增強吉西他濱(Panc-1和MiaPaca-2，5μg/ml；Bxpc-3，0.5μg/ml)抑制胰腺癌細胞的活力(P＜0.05)。 3.4Emodin在體外增加吉西他濱誘導胰腺癌細胞凋亡胰腺癌細胞接受Emodin(Bxpc-3，40μM；Panc-1，80μM)、吉西他濱(Panc-1，5μg/ml；Bxpc-3，0.5μg/ml)和聯(lián)合處理24h后，流式細胞術(shù)顯示聯(lián)合治療引起凋亡細胞比例顯著增多(P＜0.05，)，

10、聯(lián)合治療后Caspase3酶活性及PARP剪切片斷增加，提示Emodin能夠增加吉西他濱誘導的細胞凋亡。 3.5Emodin在體內(nèi)增加吉西他濱對胰腺癌種植瘤生長的抑制治療結(jié)束后，聯(lián)合治療組的腫瘤體積顯著小于對照組和吉西他濱組(P＜0.05)，而所有動物無死亡，各組間的體重在治療期間無顯著差異，肝腎功能無差異，顯示良好的耐受性。與對照組和單用藥比較，聯(lián)合治療可以明顯提高胰腺癌細胞的凋亡，并降低增殖基因Ki-67的表達(P＜0.05

11、)。 3.6Emodin在體外增加吉西他濱療效的機制采用RT—PCR、qRT—PCR．和Westernblot方法發(fā)現(xiàn)吉西他濱可以上調(diào)survivin的表達，而Emodin通過下調(diào)胰腺癌細胞吉西他濱耐藥相關(guān)基因HS3ST1，AKRC13和survivin，達到增強吉西他濱療效的作用。 4．結(jié)論 4.1利用基因芯片技術(shù)，篩選出了一些顯著的胰腺癌吉西他濱耐藥基因4.2Emodin在體外對胰腺癌細胞有明顯的誘導凋亡及抑