選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑通過Rho-ROCK通路對2型糖尿病合并非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟保護作用機制的研究.pdf

1、目的:
　　非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是常見的慢性肝臟疾病。環(huán)氧合酶-2(Cyclooxygenase-2，COX-2)是前列腺素合成的關(guān)鍵酶，在正常肝臟中幾乎不表達，而在非酒精性脂肪性肝炎肝臟中高表達，COX-2同時可影響Rho/ROCK通路在肝臟的表達水平。本實驗研究的目的是探討選擇性環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來昔布(celecoxib)是否通過直接抑制COX-

2、2以及經(jīng)Rho/ROCK通路間接抑制COX-2共同作用對2型糖尿病(T2DM)合并非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）大鼠肝臟起到保護作用。
　　方法:
　　雄性SD大鼠40只，隨機等分為T2DM-NASH組、T2DM-NASH+celecoxib、對照組、對照+celecoxib組四組，其中T2DM-NASH及T2DM-NASH+celecoxib組喂以高糖高脂飼料，對

3、照組及對照+celecoxib組予基礎(chǔ)飼料(25kJ/kg)喂養(yǎng)，4周后T2DM-NASH組及T2DM-NASH+celecoxib組腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ，30mg/kg)誘導(dǎo)T2DM模型，而對照及對照+celecoxib組腹腔注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，STZ注射4周后T2DM-NASH+celecoxib組及對照+celecoxib組予塞來昔布(10mg/kg·d)溶于生理鹽水中灌胃4周，剩余兩組大鼠予等體積生理鹽水灌胃

4、4周。第12周末處死動物，取肝臟組織，行HE染色觀察肝臟病理改變;免疫組化及Western blot檢測RhoA、ROCK1及ROCK2蛋白在肝臟的表達;Real-timePCR定量檢測RhoA、ROCK1及ROCK2mRNA在肝臟的表達情況。
　　結(jié)果:
　　1、塞來昔布具有改善肝臟炎癥的作用
　　對照組及對照組+celecoxib組肝細胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝竇正常，無炎癥細胞浸潤和壞死，

5、T2DM-NASH組可見肝細胞腫脹變大，以大泡性脂肪變?yōu)橹?，鄰近的肝細胞呈氣球樣變，肝小葉內(nèi)及匯管區(qū)散在多形核白細胞及單個核細胞浸潤，偶可見竇周纖維化。T2DM-NASH+celecoxib組可見肝細胞腫大，但炎細胞浸潤程度較輕。評分:T2DM-NASH組(6.2±0.45)，T2DM-NASH+celecoxib組（3.8±0.45），對照組（0.8±0.45），對照+celecoxib組（1±0.71）。
　　2、塞來昔布抑制

6、T2DM-NASH大鼠肝臟中RhoA蛋白和mRNA的表達
　　免疫組化結(jié)果顯示RhoA表達的表達量分別為T2DM-NASH組(0.36±0.02)，T2DM-NASH+celecoxib組（0.34±0.02），對照組（0.13±0.01），對照+celecoxib組（0.19±0.05）;Western blot結(jié)果顯示RhoA蛋白表達量分別為T2DM-NASH組（1.64±0.62），T2DM-NASH+celecoxib組(

7、0.92±0.10)，對照組（0.71±0.10），對照+celecoxib組（0.53±0.19），Real-timePCR結(jié)果顯示RhoAmRNA表達的倍數(shù)分別為T2DM-NASH組（1.87±0.21），T2DM-NASH+celecoxib組（1.12±0.21），對照組（1.00±0.05），對照+celecoxib組（0.99±0.07）。T2DM-NASH及T2DM-NASH+celecoxib組RhoA蛋白、mRNA表達

8、水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，T2DM-NASH+celecoxib組RhoA表達水平低于T2DM-NASH組(P＜0.05)，塞來昔布能顯著抑制非酒精性脂肪性肝炎合并2型糖尿病大鼠肝臟中RhoA的表達。
　　3、塞來昔布抑制T2DM-NASH大鼠肝臟中ROCK1蛋白和mRNA表達
　　免疫組化結(jié)果顯示ROCK1表達量分別為T2DM-NASH組（0.21±0.02），T2DM-NASH+celecoxib組（0.16

9、±0.02），對照組（0.16±0.01），對照+celecoxib組（0.18±0.01）;Westernblot結(jié)果顯示ROCK1蛋白表達量分別為T2DM-NASH組（1.09±0.07），T2DM-NASH+celecoxib組（0.88±0.14），對照組（0.70±0.15），對照+celecoxib組（0.61±0.15），Real-timePCR結(jié)果顯示ROCK1mRNA表達的倍數(shù)分別為T2DM-NASH組（2.27±0.

10、91），T2DM-NASH+celecoxib組（1.18±0.23），對照組（1.23±0.19），對照+celecoxib組（1.51±0.44），統(tǒng)計分析結(jié)果表明T2DM-NASH及T2DM-NASH+celecoxib組ROCK1蛋白、mRNA表達水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，T2DM-NASH+celecoxib組ROCK1表達水平低于T2DM-NASH組(P＜0.05)，塞來昔布能顯著抑制T2DM-NASH大鼠肝臟中

11、ROCK1的表達。
　　4、塞來昔布抑制T2DM-NASH大鼠肝臟中ROCK2蛋白和mRNA表達
　　免疫組化結(jié)果顯示ROCK2表達量分別為T2DM-NASH組（0.30±0.05），T2DM-NASH+celecoxib組（0.27±0.03），對照組（0.27±0.04），對照+celecoxib組（0.29±0.03）;Westernblot結(jié)果顯示ROCK2蛋白表達量分別為T2DM-NASH組（1.42±0.18），

12、T2DM-NASH+celecoxib組（1.06±0.26），對照組（0.93±0.34），對照+celecoxib組（0.85±0.13），Real-timePCR結(jié)果顯示ROCK2mRNA表達的倍數(shù)分別為T2DM-NASH組（4.71±1.25），T2DM-NASH+celecoxib組（2.89±1.07），對照組（1.01±0.12），對照+celecoxib組（1.36±0.68），統(tǒng)計分析結(jié)果表明T2DM-NASH及T2D

13、M-NASH+celecoxib組ROCK1蛋白、mRNA表達水平均顯著高于對照組(P＜0.05)，T2DM-NASH+celecoxib組ROCK2表達水平低于T2DM-NASH組(P＜0.05)，塞來昔布能顯著抑制T2DM-NASH大鼠肝臟中ROCK2的表達。
　　結(jié)論:
　　1、選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對T2DM-NASH肝臟具有保護作用。
　　2、塞來昔布抑制肝臟脂肪性炎癥，其機制可能是選擇性COX-2抑